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1、第二章.细胞生物学研究方法,显微镜技术 细胞的分离和培养 细胞组分的分离和纯化技术 细胞化学和细胞内分子示踪技术 细胞功能基因组学研究技术,第一节 显微技术,光学显微镜:以可见光(或紫外线)为光源。 电子显微镜:以电子束为光源。,3. 分辨力:指分辨物体最小间隔的能力。 R=0.61/NA 其中为入射光线波长;NA为镜口率 sin/2,n=介质折射率;=镜口角(样品对物镜镜口的张角) 。 思考:如何提高显微镜的分辨能力?,1. 构成: 照明系统 光学放大系统 机械装置 2. 原理:经物镜形成倒立实像,经目镜进一步放大成像。,(一)普通光学显微镜,(二)荧光显微镜 Fluorescence mi
2、croscope,特点:光源为紫外线,波长较短,分辨力高于普通显微镜; 有两个特殊的滤光片; 照明方式通常为落射式。,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。 1.环形光阑(annular diaphragm):位于光源与聚光器之间。 2. 相位板(annular phaseplate):物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,(四)相差显微镜,倒置显微镜 inverse microscope,物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上, 用于观察
3、培养的活细胞,通常具有相差物镜,有的还具有荧光装置。,Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green,用于观察能激发出荧光的结构。用途:免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色),(三)激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源,逐点、逐行、逐面快速扫描。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜,但能扫描不同层次,形成立体图像。,激光共聚
4、焦扫描显微镜,二、电子显微镜,(一)透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM,透射电子显微镜,TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE,TEM,20世纪60年代问世,用来观察标本表面结构。 分辨力为610nm,由于人眼的分辨力(区别荧光屏上距离最近两个光点的能力)为0.2mm,扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。,(二)扫描电子显微镜,人类红细胞,酵母,人类精子,Low speed,High speed,Differential centrifugation,差速离心的原理,原代培养(primar
5、y culture),直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养,原代培养 (primary culture):即:直接来自动物机体的首次培养。 传代培养(Passage):将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养。 。,细胞融合,单克隆抗体技术,1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术,获得1984年诺贝尔医学奖,基因克隆(gene cloning),这项技术可概括为分、切、连、转、选,动物细胞核移植克隆技术,1997年,英国苏格兰罗斯林研究所 细胞融合技术 动物体细胞克隆,转基因敲除小鼠的获得,利用同源重组(基因打靶)使基因失活的方法 基因敲除是一套组合技术,包括基因重组、细胞分离、转基因等 两个关键技术:体外重组与转基因鼠,基因敲进(knockin),将外源有功能的基因(基因组中原先不存在.或已失活的基因),转如细胞与基因组中的同源序列进行同源重组,插入到基因组中,在细胞内获得表达,称为基因敲进.,
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