浙江大学王镜岩生物化学(甲)上第03章 氨基酸.ppt
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1、Chapter 3 氨基酸,蛋白质是生物功能的体现者,而构成蛋白质的基本单位是氨基酸。蛋白质在酸、碱或酶的作用下,可逐步降解为氨基酸。组成蛋白质的氨基酸常见的有20种。成千上万的不同蛋白质实际上就是氨基酸的种类、数目及排列顺序不同。,Section 1 蛋白质水解,用H+,OH-或酶将蛋白质彻底水解,可以得到许多种氨基酸的混合物,说明氨基酸是蛋白质的基本结构单位。 蛋白质 蛋白胨 多肽 二肽 氨基酸 Mr: 大于 104 2x103 1000500 200 100,1、酸水解,条件:510倍的20%的盐酸煮沸回流1624小时,或加压于120水 解2小时。 优点:可蒸发除去盐酸,水解彻底,终产物
2、为L氨基酸,产物单一,无消旋现象。 缺点:色氨酸破坏,并产生一种黑色的物质:腐黑质,水解液呈黑色。 2、 碱水解 条件:4mol/L Ba(OH)2 或6mol/L NaOH煮沸6小时。 优点:水解彻底,色氨酸不被破坏,水解液清亮。 缺点:产生消旋产物,破坏的氨基酸多,一般很少使用。 3、 蛋白酶水解 条件:蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶,常温3740,pH值58 优点:氨基酸不被破坏,不发生消旋现象。 缺点:水解不完全,中间产物多。 蛋白质酸碱水解常用于蛋白质的组成分析,而酶水解用于制备蛋白质水解产物。,Section 2 氨基酸的结构通式,2). 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子都为
3、不对称碳原子,所以:A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,1、氨基酸的结构 氨基酸是蛋白质水解的最终产物,是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种,除脯氨酸和羟脯氨酸外,这些天然氨基酸在结构上的共同特点为:,1). 与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基,因而称为-氨基酸,COOH H2N C H R R基团,-氨基酸基本结构通式,2、构成蛋白质的氨基酸的结构特征,(1)除Pro外,都属-氨基酸,Pro 为-亚氨基酸: (2)都属L-氨基酸; (3)除Gly外,都具有旋光性; (4)为两性电解质
4、。 由于R基团不同,各种氨基酸在性质上的差异很大,如吸收光谱、等电点(pI)、解离常数(Ka)、颜色反应、稳定性、对金属的络合能力等。因此,不同氨基酸组成的蛋白质,性质和功能千差万别。,中性aa (1)按R基团的酸碱性分 酸性aa 碱性aa (2)按R基团的 非极性aa(9种) 电性质分 极性不带电荷aa(6种) 极性aa 带正电荷aa(3种) 带负电荷aa(2种),脂肪族aa(3)按R基团的化学结构分 芳香族aa 杂环族aa,Section 3 氨基酸的分类,1.构成蛋白质的20种氨基酸,2.人体所需的八种必需氨基酸,赖氨酸(Lys) 缬氨酸(Val) 蛋氨酸(Met) 色氨酸(Try) 亮
5、氨酸(Leu) 异亮氨酸(Ile) 酪氨酸(Thr) 苯丙氨酸(Phe) 婴儿时期所需: 精氨酸(Arg)、组氨酸(His) 早产儿所需:色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys),3.几种重要的不常见氨基酸 在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸,通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下,Section 4 氨基酸的重要理化性质,1.一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异,溶解性:各种氨基酸在水中的溶解度差别很大,并能溶解于稀酸或稀碱中
6、,但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2) 熔点:氨基酸的熔点极高,一般在200以上。 (3) 味感:其味随不同氨基酸有所不同,有的无味、有的为甜、有的味苦,谷氨酸的单钠盐有鲜味,是味精的主要成分。 旋光性:除甘氨酸外,氨基酸都具有旋光性,能使偏振光平面向左或向右旋转,左旋者通常用(-)表示,右旋者用(+)表示。 (5)光吸收:构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收,但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,酪氨酸的max275nm,275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm
7、,257=2.0x102; 色氨酸的max280nm,280=5.6x103;,2.氨基酸的两性解离性质,氨基酸在结晶形态或在水溶液中,并不是以游离的羧基或氨基形式存在,而是离解成两性离子。在两性离子中,氨基是以质子化(-NH3+)形式存在,羧基是以离解状态(-COO-)存在。 在不同的pH条件下,两性离子的状态也随之发生变化,pH 1 7 10 净电荷 +1 0 -1 正离子 两性离子 负离子 等电点PI,氨基酸既含有氨基,能像碱一样接受H+,又含有羧基,像酸一样可电离出H+,所以氨基酸具有酸碱两性性质,是一类两性电解质。 As an acid(proton donor): As a bas
8、e(proton acceptor):,不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在: 氨基酸所带静电荷为“零”时,溶液的pH值称为该氨基酸的等电点(isoelectric point),以pI表示。,实验证明在等电点时,氨基酸主要以两性离子形式存在,但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式,还有极少量的中性分子。 当溶液的pH=pI时,氨基酸主要以两性离子形式存在。 pHpI时,氨基酸主要以负离子形式存在。,3.氨基酸的等电点,当溶液浓度为某一pH值时,氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等,净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点,简称pI。在等电点时,氨基酸既不向正极也不向负极移
9、动,即氨基酸处于两性离子状态。 侧链不含离解基团的中性氨基酸,其等电点是它的pKa1和pKa2的算术平均值:pI = (pKa1 + pKa2 )/2 同样,对于侧链含有可解离基团的氨基酸,其pI值也决定于两性离子两边的pKa值的算术平均值。 酸性氨基酸:pI = (pKa1 + pKaR-COO- )/2 碱性氨基酸:pI = (pKa2 + pKaR-NH2 )/2,各种aa都有各自的等电点。在酸性溶液中(pHpI)带负电荷。 例:在pH=6.0的混合溶液中 Ala兼性离子 Lys带正电荷 Glu带负电荷,在溶液的任一条件下: pH=pKa+lg质子受体/质子供体 对于中性aa,加酸 pK
10、a 取pKa1 加碱 pKa 取pKa2 知道了溶液的pH,即可计算出在任一pH条件下,一种aa中各种离子的比例。,4.氨基酸的化学性质 (1)与茚三酮的反应,氨基酸与水合茚三酮共热,发生氧化脱氨反应,生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 加热过程中酮酸裂解,放出CO2,自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合,生成蓝紫色化合物。,反应要点 A.该反应由NH2与COOH共同参与 B.茚三酮是强氧化剂 C.该反应非常灵敏,可在570nm测定吸光值 D. 测定范围:0.550g/ml E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质(不释放NH3)
11、应用: A.氨基酸定量分析(先用层析法分离) B.氨基酸自动分析仪: 用阳离子交换树脂,将样品中的氨基酸分离,自动定性定量,记录结果。,(2)与甲醛反应,反应特点 A.为- NH2的反应 B.在常温,中性条件,甲醛与- NH2很快反应,生成羟甲基衍生物,释放氢离子。 应用:氨基酸定量分析甲醛滴定法(间接滴定) A.直接滴定,终点pH过高(12),没有适当指示剂。 B.与甲醛反应,滴定终点在9左右,可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子,相当于一个氨基(摩尔比1:1) D.简单快速,一般用于测定蛋白质的水解速度。,(3) 与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应,反应特点 A.为- NH2的反应 B
12、.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃) C.在弱碱性条件下,与DNFB发生芳环取代,生成二硝基苯氨基酸 应用:鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 A.虽然多肽侧链上的- NH2、酚羟基也能与DNFB反应,但其生成物,容易与- DNP氨基酸区分和分离,首先由Sanger应用,确定了胰岛素的一级结构 A. B.水解DNP-肽,得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D. 由Edman于1950年首先提出 为- NH2的反应 用于N末端分析,又称Edman降解法,肽分子与DNFB反应,得DNP-肽,层析法定性DNP-氨基酸,得出N端氨基酸的种类、数目,(4)与异硫氰
13、酸苯酯(PITC)的反应,Edman (苯异硫氰酸酯法)氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环,将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,肽链(N端氨基酸)与PITC偶联,生成PTC-肽 环化断裂:最靠近PTC基的肽键断裂,生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链,同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸 分离PTH-氨基酸 层析法鉴定 Edman降解法的改进方法- DNS-Edman降解法 用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸 原理DNFB法相同 但水解后的DNS-氨基酸不需分离,可直接用电泳或层析法鉴定 由于DNS有强烈荧光,灵敏度比DNFB法高100倍
14、,比Edman法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量,用Edman降解法提供逐次减少一个残基的肽链 灵敏度提高,能连续测定。 多肽顺序自动分析仪 样品最低用量可在5pmol,(5)与荧光胺的反应 - NH2的反应 氨基酸定量,(6)与5,5-双硫基-双(2-硝基苯甲酸)反应 -SH的反应 测定细胞游离- SH的含量,(7)其他反应 成盐、成酯、成肽、脱羧反应,Section 5 氨基酸的分析分离,常用的方法有: 滤纸层析法(filter-paper chromatography: FPC) 薄层层析法(thin-layer chromatography: TLC) 离子交换层析法(Ion-ex
15、change column chromatography: IEC) 气液色谱法(gas-liquid chromatography : GLC) 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography: HPLC) 电泳技术,一、滤纸层析法(FPC),以滤纸作为支持物。 滤纸吸附的水为固定相(S) 用水饱和的有机溶剂作流动相(L) 在互不相溶的两相溶剂中,根据分配系数不同而分离物质的方法称为分配系数法。(主要与物质的极性有关) 分配系数(Ka)= 溶剂在流动相中的浓度/溶剂在固定相中的浓度 迁移率(Rf) = 原点到层析中心点的距离/原点到层析前沿的距离
16、 即在一定条件下,被分离物质在纸上移动的距离与溶剂移动的距离之比。 在一定条件下,某种aa的Rf 值是一定的, 不同aa的Rf 值是不同的。 可利用两种不同的展层剂,进行双相层析(详见 P151图3-25)。,二、离子交换层析(IEC),离子交换剂是一种不溶于水、不溶于有机溶剂、不溶于酸碱的高分子化合物。根据所带基团又可分为: 1、阳离子交换剂 含-SO3H (强酸型) H型 -COOH(弱酸型) 若以Na+置换H+: -SO3Na Na型 -COONa,2、阴离子交换剂: 含-N+(CH3)3OH(强碱型) OH型 -N+H3OH (弱碱型) 若以Cl-置换OH-, -N+(CH3)3Cl
17、Cl型 -N+H3Cl 如:732型阳离子交换树脂(pH1-2)分离aa: (1)转型:由H型Na型 (2)上样:混合aa (3)洗脱:提高洗脱液的pH或离子强度 aa的洗脱顺序:先酸性aa、再中性aa、后碱性aa。 若用阴离子交换树脂分离aa,洗脱顺序则相反。,蛋白质存在于所有的生物细胞中,是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础,它参与了几乎所有的生命活动过程。,Chapter 4 蛋白质的共价结构,Section 1 概 述,一、蛋白质的定义 蛋白质:是一切生物体中普遍存在的,由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子;其种类繁多,各具有一定的相对分子质量,复杂
18、的分子结构和特定的生物功能;是表达生物遗传性状的一类主要物质。 二、蛋白质在生命中的重要性 早在1878年,思格斯就在反杜林论中指出:“生命是蛋白体的存在方式,这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。” 可以看出,第一,蛋白体是生命的物质基础;第二,生命是物质运动的特殊形式,是蛋白体的存在方式;第三,这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断,1.蛋白质是生命机体的重要组成成分,蛋白质占干重 人体中(中年人) 人体 45% 水55% 细菌 50%80% 蛋白质19% 真菌 14%52% 脂肪19% 酵母菌
19、14%50% 糖类1% 白地菌50% 无机盐7%,2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者,(1)酶的催化作用 (2)调节作用(多肽类激素) (3)运输功能 (4)运动功能 (5)免疫保护作用(干扰素) (6)接受、传递信息的受体 (7)毒蛋白,3.外源蛋白质有营养功能,可作为生产加工的对象.,三、蛋白质的组成,1.元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物,除含有碳、氢、氧外,还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素,主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为: 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量,氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此,可
20、以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%,所以,可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量,蛋白质含量的测定: 凯氏定氮法 (测定氮的经典方法) 优点:对原料无选择性,仪器简单, 方法也简单; 缺点:易将无机氮(如核酸中的氮) 都归入蛋白质中,不精确。 一般,样品含氮量平均在16%,取其倒数100/16=6.25,即为蛋白质换算系数,其含义是样品中每存在1g元素氮,就说明含有6.25g 蛋白质);故: 蛋白质含量=氮的量100/166.25,除了上述法方外,还有 紫外比色法 双缩脲法 Folin酚 考马斯亮兰G250比色法 (条件:蛋白质必须是可
21、溶的),2.化学组成(两种类型) 单纯蛋白质:水解为 -氨基酸 结合蛋白质=单纯蛋白质+辅基,四、 蛋白质的分类,一. 依据蛋白质的外形分类 按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。 1.球状蛋白质:(globular protein)外形接近球形或椭圆形,溶解性较好,能形成结晶,大多数蛋白质属于这一类。 2.纤维状蛋白质(fibrous protein)分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。 二.依据蛋白质的组成分类 按照蛋白质的组成,可以分为 1.简单蛋白(simple protein) :又称为单纯蛋白质;这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链,不含其
22、它成分。 (1)清蛋白和球蛋白:albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水,球蛋白微溶于水,易溶于稀酸中。 (2)谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin):植物蛋白,不溶于水,易溶于稀酸、稀碱中,后者可溶于7080乙醇中。 (3)精蛋白和组蛋白:碱性蛋白质,存在与细胞核中。 (4)硬蛋白:存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中,分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,2.结合蛋白(conjugated protein):由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成 (1)色蛋白:由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 (2)
23、糖蛋白:由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 (3)脂蛋白:由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-,-脂蛋白等。 (4)核蛋白:由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。 (5)色蛋白:由简单蛋白与色素结合而成。如血红素、过氧化氢酶、细胞色素c等。 (6)磷蛋白:由简单蛋白质和磷酸组成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。,Section 2 肽(peptide),蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线,通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从
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