液相色及其检测技术.ppt
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1、液相色谱及其检测技术,李俊玲 2013年8月1日,主要内容,液相色谱基本知识 液相色谱常见故障及维护保养 液相色谱的应用 检测方法前处理技术 报告及数据分析 液质联用技术,1 液相色谱基本知识,1.1 液相色谱的发展,20世纪初,俄国植物学家茨维特(Tswett)提出经典液相色谱法。 1938年有了薄层色谱。1944年有了纸色谱。 20世纪50年代后,气相色谱迅速发展,液相色谱发展缓慢。 20世纪60年代末期,随着微粒固定相的研制成功,及高压输液泵和高灵敏度检测器的出现,高效液相色谱方法在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上建立起来。 20世纪70年代,往复式双柱塞恒流泵占主导地位,Kirkla
2、nd制备出多孔球形硅胶,平均粒径7m。 20世纪80年代,研制出二极管阵列紫外吸收检测器。 20世纪90年代,HPLC高速发展,联用技术,多维色谱成为活跃的新技术领域。 2000年后,亚二微米填料(色谱柱50mm),高分离度快速(超高效)液相色谱提高了分析的速度。,早期的柱色谱,玻璃柱填料: 硅胶 氧化铝 纤维素,样品,溶剂,重力 洗脱,1.2高效液相色谱的组成,什么是高效液相色谱(HPLC) 高效液相色谱的定义为: 高压泵驱动液体(流动相) 通过装填有涂层颗粒的柱管(色谱柱)将混合物分离为单一组分的色谱分离技术。,HPLC的主要组成部分 溶剂输送系统(泵) 溶剂流动相 进样器(进样阀) 色谱
3、柱固定相 检测器 数据系统,HPLC的特点 .高压:系统压力10-40MPa;(1 MPa = 10 bar =147psi) .高速:分析时间短,仅几分钟到几十分钟; .高效:柱效高为5000-30,000塔板数/m .高选择性:适于复杂、多组分样品的分离 .高灵敏度:最低检测线(LOD) UVD 10-9g; FLD 10-12g;RID 10-6g;,液相色谱仪各个模块,液相色谱仪由输液系统,进样系统,分离系 统,检测系统和记录数据处理系统五部分组成。 .2.1 输液系统 ) 流动相和储液罐 流动相有机溶剂,纯水,缓冲盐溶液等 储液罐玻璃,不锈钢,塑料容器,0.5L -4L 连接管路塑料
4、管,配有不锈钢或玻璃过滤器, 孔径为0.45m左右。,图片,液相色谱仪各个模块,2) 输液泵 A. 对泵的要求 a) 泵要耐腐蚀,一般采用不锈钢材料制成, b) 在高压下能连续工作,压力一般为 40-50MPa, 24h工作, c)输出流量范围宽,填充柱:0.1-10(mL/min) 微孔柱:0.01-10(mL/min) d) 流量稳定,流量的控制精度应小于。,液相色谱仪各个模块,B. 常用泵 气动放大泵、往复泵、螺旋注射泵、隔膜泵等几种,由于气动放大泵和螺旋注射泵存在流量调节不便、溶剂更换困难、不利于进行梯度洗脱等缺点,应用越来越少。往复式柱塞泵的应用更为普遍 。 a) 恒流泵 如往复泵
5、()注射型通过控制电机转数来改变柱塞移动速度, 操作方便,缺点是液缸容积小,不利于连续工作。 ()往复型有并联和串联两种,如安捷伦1100、1200的泵就是双柱塞、往复式串联泵。 b) 恒压泵如气动放大泵 是输出压力不变的泵,系统阻力不变时可保持恒定流量,否则流量改变。,液相色谱仪各个模块,3)梯度洗脱装置 梯度洗脱是在洗脱过程中,连续或间断的改变流动相中含有的两种或两种以上不同极性溶剂的比例,即调节流动相的极性,使样品中的组分可在最短的时间内达到满意的分离。 实现梯度洗脱,需要二元或多元泵,梯度控制装置及软件。 a 低压梯度(也叫外梯度):在常压下,预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混
6、合后,再用一台高压泵输入色谱柱。 b 高压梯度 (或称内梯度系统 ):利用两台高压输液泵,将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室,混合后,进入色谱柱。,气动放大泵(恒压) 往复式柱塞泵(恒流),液相色谱仪各个模块,1.2.进样系统 定量地将试样注入色谱系统的装置。 1) 六通阀进样器 耐高压,死体积小,不锈钢材料制成,定量管体积5-10L。 2) 自动进样器 由计算机控制,按预先编制的进样程序进行,进样量连续可调,重复性好。,液相色谱仪各个模块,1.2.分离系统 包括色谱柱和柱箱及控温部分 )色谱柱 内壁抛光的直型柱管,内装固定相,标准柱长一般为10-50cm,内径4.6mm,微孔柱内
7、径0.5-1.0 mm。,液相色谱仪各个模块,)柱箱及控温部分 要求控制柱温的情况: a. 标准分析中,要求保留时间再现; b. 通过改变柱温提高分离效率; c. 分析高分子化合物或大黏度样品: d. 有生物活性的样品柱温要低于室温; e. 复杂样品采用二维色谱技术,需在不同温度下操作。 柱箱控温范围:低于室温10-80,对凝胶渗透色谱,柱温从室温到150。,液相色谱仪各个模块,1.2. 检测系统 检测器是液相色谱三大关键部件之一,用于监测色谱柱分离后组分浓度的变化,由记录仪绘出色谱图来进行定性定量分析。 理想的检测器应具有以下特征:a. 灵敏度高,b.对所有溶质都有快速响应,c.线性范围宽,
8、d.适用范围广等。 常用的检测器有: 紫外吸收检测器,荧光检测器,示差折光检测器,电导检测器等。,液相色谱仪各个模块,1)紫外吸收检测器 A)固定波长 由光源(低压汞灯),滤光片,流通池,光电池接收器等组成.波长为254nm, 280nm,流通池体积为5-10L,光路为 5-10mm。光电池接收信号经放大输出。 B) 可变波长 一般采用氘灯和钨灯作光源,波长在190-700nm范 围内,由光栅将光分为单色光,由光电二极管接收某一特定波长的信号。,液相色谱仪各个模块,1)紫外吸收检测器 C)光二极管阵列检测器 是一种新型的紫外吸收检测器,进入流通池的不是单色光,获得的信号是全部紫外光波长的色谱信
9、号,因此不仅可以进行定量检测,还可以提供组分的光谱定性信息。 采用钨灯和氘灯做光源,光照射到流通池上,透过光经光栅色散后,投射到由1024个二极管组成的阵列上被检测。 全部检测过程由计算机控制,不仅可以绘制随时间的变化进入检测器的液流的光谱吸收曲线吸光度随波长的变化曲线,可以画出三维立体谱图。,液相色谱仪各个模块,)荧光检测器 利用某溶质在受紫外光激发后可发射荧光的性质进行检测的是一种高灵敏度选择性检测器。 激发光源常用氙灯,可发出250-600nm连续波长的强光,经透镜单色器分出有一定波长的激发光,照射在流通池上,溶质受激发后产生的荧光,经聚光和单色器,选择出需要检测波长的光,聚焦在光电倍增
10、管上,将光转变成电信号,经放大输出到微处理机。,液相色谱仪各个模块,)示差折光检测器 是通过连续监测参比池和测量池中溶液的折光率之差来测量试样的浓度的,是一种通用型检测器。由于它对流动相的任何变化都有响应,因此不能用于梯度洗脱。另外受温度影响波动大,灵敏度低,使用时有一定限制。,液相色谱仪各个模块,)电导检测器 是一种选择性检测器,通过测量流动样品的电导或电阻进行检测,主要用于检测以水溶液为流动相的离子型溶质,在离子色谱中应用广泛。 有代表性的电导检测器是双电极微型检测器和五电极电导检测器。,液相色谱仪各个模块,1.2.5 色谱数据处理系统 1) 记录仪, 绘制色谱图。 2) 微处理机,与色谱
11、仪连接构成一个比较完整的色谱分析系统。它包括一定容量的程序存储器,方法存储器,数据存储和谱图记录和显示器等,通过键功能给出操作参数指令。 3) 色谱工作站,全部操作参数的控制,多台仪器控制,网络运行功能等。,1.3 液相色谱的分离模式,HPLC的分离模式,主要有四种 反相色谱 正相和吸附色谱 离子交换色谱 尺寸排阻色谱,1.3.1 反相色谱 柱填料是非极性的(如,C18, C8, C3, 苯基,等.) 流动相是水(缓冲液)+可与水混溶的有机溶 剂(如,甲醇、乙腈) 反相色谱( RPLC 或RPC )是最常用的模式 90%以上的色谱工作者都用这种模式,或者说大多数液相色谱的检测,都是这种模式。
12、这种技术可用于分离非极性、极性、可离子化的 和离子型分子 .RPC 的适用性非常广泛,对于包含各种化合物的样品来说,经常要采用梯 度洗脱 .开始时流动相以水为主,然后随着时间延长逐渐加入有机溶剂。有机溶剂增加了溶剂强度,洗脱在RPC填料上保留很强的化合物。,1.3.2 正相色谱 在这一模式中,柱填料是极性的(如,硅胶、氰丙基 键合、氨基键合等),而流动相是非极性的(如己 烷、异辛烷、二氯甲烷、醋酸乙酯) 进行正相分离的实验不到10% 这项技术有以下应用: .水敏性化合物 .几何异构体 .顺-反异构体,1.3.3 离子交换色谱,离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团, 这些带电基团通过静电相互
13、作用与带相反电荷的离子结合。 如果流动相中存在其他带相反电荷的离子,按照质量作用定律,这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。 固定相基团带正电荷的时候,其可交换离子为阴离子,这种离子交换剂为阴离子交换剂; 固定相的带电基团带负电荷,可用来与流动相交换的离子就是阳离子,这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。,阴离子交换柱的功能团主要是NH2,及NH3 : 阳离子交换剂的功能团主要是SO3H及COOH。 其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂,它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力; -NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂,只有在一定的pH值范围内,才能有离子交
14、换能力。 离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离,例如,氨基酸自动分析仪中的色谱柱,多肽的分离、蛋白质的分离,核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。,1.3.4 尺寸排阻色谱,空间排阻色谱法又名尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography,SEC),是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。 被广泛应用于大分子分级,即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 其固定相为化学惰性多孔物质凝胶, 凝胶具有一定大小的孔穴,体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻,较早的淋洗出来;中等体积的分子部分渗透;小分子可完全渗透入内,最后洗出色谱柱。 这样,样品分子基本按其分子大小先后排阻,
15、从柱中流出。,2 液相色谱仪的日常维护与常见故障排除,2.1 液相色谱仪的日常维护,2.1.1 储液器 流动相使用HPLC级试剂/溶剂; 含缓冲盐的流动相过0.45m膜除去微粒物质;更换流动相时,应彻底清洗,防止交叉污染; 定期清洁储液器及过滤白头,防止滋生微生物。,2.1.2输液泵,密封垫易损坏引起故障,每天实验结束一定要认真冲洗泵,注意防止堵塞,使用缓冲盐流动相时,更要小心。可以配备泵的在线清洗装置。 使用HPLC级试剂,注意泵压力不要太高,要适当调整压力,一般压力上限在10-20MPa,下限为0.5MPa,注意防止因泵堵塞造成压力过高损坏柱塞杆或烧坏电机 。,2.1.3 进样器,停机前一
16、定冲洗干净进样器内残留的样品或缓冲盐,防止样品和无机盐沉积造成进样阀转子面磨损或堵塞。 注射器最好使用仪器自配尖头、平头针,不要用其它仪器的。,2.1.4 色谱柱防止柱性能下降,1 溶剂的化学腐蚀性不能太强; 2 避免颗粒物在柱头沉降; 3 柱压不能太高,防止冲击太大; 4 流动相pH值小于7时,最好用大粒度同种填料的予 柱; 5 柱头加滤片(烧结不锈钢), 需要时加保护柱; 6 经常清洗柱; 7 长时间不用时要保存好,一定要洗去缓冲盐,加入有机溶剂(如乙腈、甲醇均可),将柱两端拧紧,保持柱填料湿润。,2.1.5 检测器,1.保持清洁,每天用后与色谱柱一起清洗; 2.使用脱过气的流动相,防止气
17、泡滞留池内; 3.检测器灯有一定寿命,不用时不开灯。,2.1.6 记录器数据处理系统,记录仪: 热敏式打印头要注意记录纸的质量,开机前注意检查走纸部件,不要卡纸。 色谱工作站: 防止网上病毒损坏软件。不用移动硬盘或是U盘等拷贝工作站上的数据,如果必须拷贝,也只用仪器专用的。,2.2 常见故障的排除,2.2.1 储液器 1)脱气不充分(噪声大,出毛刺) 用He脱气 真空脱气 超声脱气 加热回馏脱气(混合流动相不宜),2)流动相供给不畅,泵压力不稳 流动相接近用完,可能吸入部分气体; 过滤器(过滤白头)堵塞(有颗粒,长霉); 可能是流速过高,阻力大,造成走空现象。 解决办法: 更换流动相,清洗过滤
18、器,降低流速,加大管路内径;抬高储液器。,3)储液器或流动相被污染 产生有规则的噪声; 基线上升,梯度洗脱出鬼峰; 原因: 溶剂质量差(含杂质多); 配流动相的玻璃器皿不干净,微生物影响; 配制流动相的操作不当(过滤、脱气、搅拌),2.2.2 输液泵,1)单向阀 a.球和阀座粘在一起,堵死,打不出溶剂,(缓冲盐流动相) 用高质量的溶剂冲洗,不同极性溶剂冲洗,如水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷,更换新单向阀。 b. 球和阀座密封不严,压力不稳,气泡进入阀中,紧贴在阀体内,使球难以返回阀座,引起倒流,压力和流速变化大,可能有小晶体颗粒。 清除气泡的办法:打开排液阀,大流量冲洗,用脱过气的甲醇冲洗,一般可
19、解决问题。,2)泵垫圈磨损或破碎:高压下压力不稳,从泵头往外渗漏流动相,色谱峰的保留时间会改变。 解决办法:更换新垫圈。更换方法按维修说明书上的方法一步步操作。或是请工程师上门,尤其是头一次维修。 注意: 输液泵的垫圈要和流动相匹配协调。多数垫圈和流动相是协调的,但有的垫圈适用于甲醇、水、乙腈,在四氢呋喃中溶解、变粘、变软。 需换垫圈时,应向厂商咨询垫圈的规格型号。 色谱工作者一般应学会换密封垫圈。,3)柱塞杆故障 磨损、漏液 使用不当被折断 柱塞杆被卡住,不能运动。 更换新柱塞杆 请维修工程师帮助解决,或参照专门的操作手册自己动手更换。,2.2.3 进样系统,1) 渗漏 转子密封垫圈松紧不合
20、适; 垫圈不配套; 组装不对。 2) 堵塞, 样品打不进去。 样品管堵塞:环管用反冲法或超 声清洗排除(或换新管).,手动进样系统器,3) 注样孔 a) 装样时针头周围渗漏:孔道堵塞,或者放空管和样品管太细,阻力太大;针头密封管规格不对,针头太细。 b)样品滞留 阀在进样位置停留时间不够。 要求停留时间至少应让流动相流过的体积是环体积的10-20倍。 (一般是在下一针进样前才将阀扳到装样位置),2.2.3进样系统,a. 样品瓶不配套 瓶小针弯、折断 瓶大样品少,抽不上样 瓶破碎 更换合适的样品瓶。 b. 注意样品瓶隔垫,防止污染。 c. 进样器针头堵塞(样品、缓冲盐、隔垫碎片、针头本身), 可
21、用溶剂清洗,金属丝疏通,或换新针头。,自动进样系统,2.2.3进样系统,d. 样品滞留:空白溶剂出色谱峰. 加倍清洗,或调整样品瓶顺序,(从低浓度开始,高浓度放后 面)或在样品瓶前放清洗液瓶.,自动进样系统,2.2.4 色谱柱,色谱柱是色谱系统的心脏 正确选择色谱柱是液相成功分析的关键 1)塔板数下降 a. 样品处理不合适,选择适当的样品净化方法,选择合适流动相。 b. 柱头塌陷,填装修补,最好专业人士来做。 2)峰形变坏 出现拖尾峰,分叉峰,非高斯峰。 与塔板数下降有关,峰形坏保留时间不变, 可能是柱堵塞(不锈钢烧结片),或柱头有空穴。,不同分离模式的色谱柱 反相色谱柱:C18,C8,C3,
22、苯基,氰基等 正相色谱柱:硅胶,氨基,氰基,二醇基等 离子交换柱:有强阴,强阳,弱阴,弱阳之分 体积排阻柱:凝胶渗透色谱柱与凝胶过滤色谱柱 手性柱:用于手性化合物拆分 亲和色谱柱:依据溶质与填料上配基之间的分子识别特性 而实现分离,2.2.4 色谱柱,3)柱压突然增大 样品沉积在柱内,用能溶解样品的溶剂冲洗(断开柱和检测器)可正向冲,反向冲。 柱内硬件有问题: 滤片堵塞,换新片; 塌陷:用相同填料填充、修补。,2.2.4色谱柱,4)保留时间改变 不同柱保留时间的变化,主要是填料差异造成的,不同牌号柱出峰顺序不变,保留时间有小的变化。 若峰顺序变化,保留时间变化较大,应考虑换柱或优化分离条件。
23、对专门的分析最好用同一批号的柱子。,由色谱柱引起的故障,理论塔板数,理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。 N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布,N可近似表示为: N=(tR/)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2 W:峰宽 ; :曲线拐点处峰宽的一半,即峰高0.607处峰宽的一半。 N为常量时,W随tR成正比例变化。 在一张多组分色谱图上,如果各组份含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。
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