色谱基础理论-20140321.ppt
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1、色谱基础理论,林直宏 Email:L,目录,三,高效气相色谱仪的结构与原理,一、色谱法的基本理论,80%-85%的有机化合物,色谱法的起源,20世纪初,俄国科学家茨维(M.S.Tswett)提出经典液相色谱法后,色谱分析法取得了迅速的发展,,分离基本模型,3种组分同时进入色谱柱,3种组分开始在色谱柱中分离,3种组分在色谱柱中基本达到分离,3种组分在色谱柱中完全达到分离,色谱法,即利用组分在体系中固定相与流动相的分配差异,将混合物组分进行分离和测定的方法。,色谱分类,GC 进样方式:样品转化为液体 流动相:惰性气体,不予组分发生反应,黏度10-5Pas,输出压力0.11.0MPa。 固定相: 1
2、、分离机理:吸附、分配、络合、手性作用 2、色谱柱:填充(粒度0.1-0.5mm,柱内径1-4mm,柱长1-4m,柱效102-103;毛细(内径0.1-0.5mm,柱长10-100m,柱效103-104);柱温室温-420。 检测器:FID、TCD、ECD、FPD、NPD 应用范围:低分子量、低沸点有机化合物;永久气体。,LC 进样方式:样品需为液体 流动相:离子型、极性、弱极性或非极性溶液,可与被分析组分发生反应,黏度10-3Pas,输出压力45MPa。 固定相: 1、分离机理:吸附、分配、筛析、离子交换、亲和、手性作用。 2、色谱柱:填充(粒度5-10um,柱内径3-6mm,柱长10-25
3、cm,柱效104;柱温室温-50。 检测器:UVD、DAD、FD(荧光)、ECD(电导)、RID、ELSD 应用范围:低分子量、部分低沸点、高沸点、高分子量有机化合物;离子型化合物;生物活性物质。,基本术语,色谱图,检测信号和时间的关系图 不同的色谱峰对应相应的组分 可以得到相应组分的保留时间和峰面积信息。 保留时间 定性分析 峰面积 定量分析,基本术语,保留时间(Retention time): 组份从进样到出现最大值所需要的时间,tR 死时间(dead time): 不被固定相滞留的组份,从进样到出峰最大值所需要的时间,t0 峰高(Peak Heigh) 从峰最大值到峰底的距离, 峰面积(
4、Peak Area) 峰与峰底之间的面积,出峰异常-无峰或峰很小,GC A.色谱柱连接是否正确 B.系统是否有漏 C.检测器是否工作开启,如FID点火了吗?FID高压静电正常吗? TCD加电流了吗 D.柱中是否有载气 E.样品是否降解、沉淀,LC A.色谱柱连接是否正确 B.系统是否有漏 C.检测器是否正常,如UVD的是否能力异常,R/S是否正常;氘灯是否点亮 D.流动相组分、纯度、配比是否正常 E.样品是否降解、沉淀,基线(base line),基线(base line)经流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)基线信号的波动。
5、流动相波动、电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、色谱柱被污染所致。 漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。,基线异常-噪声、漂移变大或不规则,GC 流动相:载气不纯 气源输出不稳 气路有漏气 检测器被污染 色谱柱被污染,LC 流动相:流动相非色谱纯,使用试剂、水或药品不纯,或被污染;有气泡 泵输液不稳 检测器故障,如流过池漏液 色谱柱被污染,分离度(Resolution),当R=1 时,有5的重叠; 当R=1.5时,分离程度为99.7%,可视为基线分离 毛细管色谱柱比填充柱有更高的分辨
6、率。,两个相邻峰的分离程度。以两个组份保留值之差与其平均半峰宽值的比来表示:,峰的形状,理想的峰型是高斯曲线. 分子的理论统计学分布,拖尾因子(tailing factor,T),用以衡量色谱峰的对称性。 也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。 中国药典规定T应为0.951.05。T0.95为前延峰,T1.05为拖尾峰。,峰型异常-前伸峰,GC 峰伸舌多为色谱柱过载,减小进样量,使用大容量柱子 提高OVEN,INJ温度; 进样技巧提高。 色谱柱的连接,LC 死体积太大 样品溶液的配比极性与流动相的极性相差太大。 减少进样量; 保护柱或
7、柱失效,峰型异常-峰拖尾,GC 溶剂/固定相极性不相匹配 色谱柱安装不正确 同时有两个峰流出 分流比太小,LC 色谱柱被污染或失效 进样阀漏液,峰型异常-峰开叉,GC 进样口污染 色谱柱被污染 样品被污染,混入难分离杂质 检测器被污染,LC 保护柱污染 柱失效 样品被污染,混入难分离杂质,分配系数(distribution coefficient,K),在一定温度下,化合物在两相间达到分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。,分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。混合物中各组分的分配系数相差越大,越容易分,LC:流动相(组分比例、pH)、流速、进样量 GC:流速
8、、温度、进样量,峰展宽的度量. 以塔板数来表示 类似蒸馏中的气液平衡,柱效(Column Efficiency),例如,图示中塔板数为3.,塔板理论,理论塔板数为:,n=5.54(tR/W1/2)2,速率方程,气相色谱速率方程( Van Deemter方程),液相色谱速率方程(即Giddings方程),A B C,A B C,van Deemter曲线,(颗粒度和柱床填装的优良程度),Height Equivalent to Theoretical Plate,线速度 U (mm/sec),HETP,最低HETP =最优化的塔板数,H,(传质),(纵向扩散),HETP PLATES,影响色谱柱
9、效率的因素,A. 涡流扩散 (不同路径的影响 ).,采用细而均匀的载体,这样有助于提高柱效 毛细管柱可忽略该项,A2dp,dp为填料直径,为填充不规则因子,填充越不均匀越大。,对于HPLC来说,颗粒度越小柱效越高 颗粒度控制着分离的质量 更小的颗粒度: 使最高柱效点向更高线速度方向移动 有更宽的线速度范围 降低颗粒度不但可以增加柱效,同时也增加分离速度,van Deemter 曲线的挑战,如果填料的颗粒继续演变,HPLC(高效液相色谱法)填料颗粒尺寸的演变,如果我们使用更小颗粒度的填料会发生什么情况?,影响色谱柱效率的因素,B. 纵向扩散.,气相中分子的扩散 主要决定于气体流速,由于进样后溶质
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