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1、1,第 二十一 章,基因工程,生物化学与分子生物学 黄诒森 主编,2,将一种生物的基因与载体分子在体外进行拼接重组,转入另一生物体细胞内使之扩增并表达新的性状。 是生物技术领域的核心技术。,基因工程 genetic engineering,供体、受体、载体是DNA重组技术的三大基本元件。,在体外将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成一个新的DNA分子。 以获得单一基因或DNA片段的大量拷贝为目的,故称为基因克隆或分子克隆。,DNA重组 DNA recombination,3,基因工程 genetic engineering,广义: 包括两大部分 上游技术: 外源基因的克隆、重组、表达的设计
2、与构建(即狭义的基因工程或重组DNA技术) 下游技术: 含外源基因的重组菌或细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化与鉴定等工艺。,蛋白质工程(protein engineering): 利用克隆基因表达、制备特定的蛋白质或多肽,或定向改造基因结构获得新的蛋白质或蛋白质的新性质。,4,5,第一节 基因克隆的工具酶,6,一、限制性核酸内切酶 restriction endonuclease,一类能识别双链DNA分子内部的特异序列,并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶。,存在于多种细菌中,与相伴的甲基化酶共同构成细菌的“限制-修饰”体系,保护自身DNA,分解外来DNA。 维持细菌遗传
3、性状的稳定遗传。,(一)概念,7, 命名,基本原则:3-4个字母组成: 属名+种名+株名+序号,如:EcoR : Escherichia coli R (大肠杆菌R株),=Escherichia,埃希菌属 细菌属名第一个字母, co=coli,大肠杆菌菌种 细菌种名头二个字母, R= RY13 细菌株名头一个字母, I=第一个分离到的内切酶 酶被发现的先后顺序,(二)命名与分类,8, 分类,根据酶的结构、所需因子及裂解DNA方式的不同可分为 I、II、III类,限制性核酸内切酶,9,两种切割方式:错位切,垂直切 黏端切口、平端切口,Bam H,+,Hind,+,平头/钝性末端 (blunt e
4、nd),黏性末端 (sticky end, Cohesive end),10,Bam H,限制性核酸内切酶切割DNA均产生 5-磷酸基和3-OH的末端,+,11,EcoR 的识别序列,EcoR 的切割位点,5 G-C-T-G -A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,EcoR 切割产生5粘性末端位点,EcoR,37C,退火,4-7C,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A
5、-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,Pst切割产生3粘性末端位点,Pst37C,退火4-7C,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,Pvu 产生的平头末端,Pvu ,37C,15,某些限制性内切酶及产生的末端,16,二、其他工具酶,(二)DNA聚合酶,1.DNA聚合酶,大肠埃希菌DNA聚合酶是单一肽链的多功能酶,928个氨基酸。有3个相对独立的活性中心,分别具有53聚合酶活性
6、,35和53核酸外切酶活性。 Klenow片段(大片段)指羧基末端604个氨基酸,保留53聚合酶活性,也有35核酸外切酶活性。,17,Klenow片段是分子生物学研究的常用工具。 用途: 合成cDNA的第二条链 修复DNA片段3末端(校对活性) 标记探针3末端 DNA序列分析,18,2.Taq-DNA聚合酶(Taq酶),耐热的聚合酶,具有53聚合酶活性和53核酸外切酶活性,热稳定性好,最佳温度70-80,PCR中最常用,无35外切酶活性,无校正功能。,19,3.逆转录酶,依赖RNA的DNA聚合酶,合成互补DNA(complementary DNA,cDNA)。,功能: 逆转录作用: 53合成c
7、DNA单链 核酸酶H的水解作用: 35水解杂化双链中的RNA 依赖DNA的DNA聚合酶作用:以杂化双链中的DNA为模板,催化合成cDNA的互补链。,20,4.末端转移酶(TDT),末端脱氧核苷酰转移酶,不需要模板的DNA聚合酶。将脱氧核苷酸加到单、双链DNA分子的3-OH上,用于标记探针和构建黏性末端。,21,1.DNA连接酶(DNA ligase),一种封闭DNA链上缺口的酶,催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端形成磷酸二酯键。,大肠杆菌DNA连接酶:在DNA聚合酶1催化聚合填满双链DNA 上的单链间隙后封闭DNA双链上的单链缺口,在DNA复制、修复和重组中起作用。辅基为NAD+。 T4连
8、接酶:连接双链DNA分子的黏性末端或平末端。需ATP。,(二)DNA连接酶,22,(三)碱性磷酸酶 (Alkaline Phosphatase),切除核酸末端的5-磷酸基团。可有效防止载体自身磷酸化,提高重组效率。,23,(四)核酸酶S1,一种高度单链特异的核酸内切酶。,功能: 单链水解功能,作用于双链核酸分子的单链区,并从单链部位切断核酸分子,单链区可以小到只有一个碱基对的程度。 用于分析核酸杂交分子(RNA-DNA)的结构、给RNA分子定位、去除DNA片段中突出的单链尾产生平端、打开在双链cDNA合成期间形成的发夹环。,24,载体: 为携带目的基因,实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用
9、的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA,第二节 基因克隆的载体,25,能稳定自主复制,有较高拷贝数; 有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点; 具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定; 分子量小,以容纳较大的外源DNA。,26,穿梭载体:含有原核和真核细胞的复制元件。,27,存在于细菌中、独立于染色体、能自主复制的双链环状DNA分子。,1. 质粒(plasmid),一、克隆载体,分2类: 严格控制型:复制与宿主的繁殖偶联,拷贝数少 松弛控制型:复制与宿主的繁殖不偶联,拷贝数多,28,优点: 分子量小 易提取, 有耐药性标志
10、易导入宿主 缺点: 插入的外援基因不超过10kb,pBR322物理图谱,29,pUC18质粒物理图谱,大肠埃希菌克隆载体pUC系列质粒,有氨苄西林抗性基因和大肠埃希菌Laz基因。,30,(1)噬菌体:双链线性DNA,两端有互补单链黏性末端(cos位点),2. 噬菌体(phage),感染细菌的一类病毒。,噬菌体DNA必须包装蛋白质外壳并成熟后才能感染细菌。感染时,噬菌体DNA进入大肠埃希菌,其黏性末端环化成环状双链DNA。,31,野生型噬菌体DNA及相应的噬菌体DNA图谱,32,gt系列(插入型,插入片段6 kb,克隆效率高,适用于cDNA克隆, gt 10为代表,有EcoR I但一位点) EM
11、BL系列(取代型,插入片段可达20 kb,适用于大片段基因组克隆,有BamH I、 EcoR I 和Sal位点) 黏性质粒(cosmid)(由DNA的cos区与质粒重构而成的双链环状DNA载体,既有质粒特点,又能像噬菌体一样体外包装。克隆容量大,达40-50kb,用于构建基因组文库),人工改造噬菌体,33,(2)M13噬菌体:,DNA改造系统:序列排列紧密,改建仅限于基因之间作插入区 M13mp系列(插入E.Coli的基因片段含lacZ的基因) pUC系列 (利用pBR322和M13载体的优点构建),单链闭环状DNA,M13感染宿主菌后在菌体内酶的作用下,以感染性单链DNA为模板,复制转变为双
12、链DNA,称为复制型(RF DNA);达到一定拷贝时停止复制,产生大量单链DNA并包装。,34,(三)病毒载体,能感染动物细胞的病毒,可满足真核DNA 重组生物需要。用于对肿瘤和遗传病的研究和治疗。,常用的病毒载体: 猿猴空泡病毒(SV40) 逆转录病毒(retrovirus) 昆虫杆状病毒 腺病毒(Adenovirus,AV) 腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV),SV40,35,病毒载体构建时把细菌质粒复制起始点放置其中。改建后的病毒,含病毒启动子、包装元件、遗传标记和质粒复制起始点。,36,二、表达载体,用于在受体细胞中表达(转录和翻译)外源基因的载体。,
13、必须具备克隆载体的性质 必须带有转录和翻译所必需的元件 对不同的表达系统要构建不同的表达载体,1. 原核表达载体,常用大肠埃希菌表达载体。在克隆载体基础上还含有启动子(trc启动子、T7噬菌体启动子等)、核糖体结合位点(RBS)、转录终止序列等。,37,SV40病毒载体:最终导致宿主细胞死亡,使用受限 逆转录病毒载体:较高的整合和表达外源基因能力,要考虑安全性 腺病毒载体:第三代去除所有腺病毒的编码基因,已用于基因治疗 AVV载体:细小的DNA病毒。无致病性,感染效率高,在基因治疗中广泛使用。,2. 真核表达载体,由克隆载体发展而来,包括原核生物的序列、真核表达调控的元件(启动子、增强子、转录
14、终止、加poly A信号序列)、真核细胞的复制起始序列、真核筛选标志基因等。,38,第三节 基因克隆的一般过程,分载体和目的基因的分离 切限制性内切酶切割 接载体与目的基因连接成重组体 导基因序列导入细胞 筛目的基因序列克隆的筛选 鉴对筛选出来的重组体进行鉴定,基本流程,39,切,接,导,筛,分,基本流程图示,40,一、目的基因的获取,目的基因又称外源基因,即我们所要研究的感兴趣的基因。,41,获取目的基因的方法,1.基因组DNA文库(genomic DNA library) 2.cDNA文库(cDNA library) 3.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,
15、PCR) 4.化学合成法(DNA合成仪),42,基因组文库(genomic DNA Library), 就是用基因工程的方法,人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。即基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。 理想的基因组文库应包含该机体基因组的全部遗传信息 。,43,基因组文库技术(引自Griffiths et al.1996),构建基因组文库,分离染色体DNA,酶切片段化,与克隆载体连接,所有重组DNA分子导入宿主细胞并扩增,建立基因组DNA文库。,44,以mRNA为模板,利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(cDNA),再复制成双链cDNA片段,与适当载体连接后
16、转入受体菌,即获得cDNA文库。,cDNA文库构建(引自Old & Primrose,1980),构建cDNA文库,45,适用于已知序列基因片段的获得,变性,退火,延伸,敏感度高, 特异性强, 产率高, 重复性好, 快速简单,PCR是一种利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。,用PCR技术获取目的基因,46,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,47,二、选择与制备合适的基因载体,选择载体的依据: 克隆的目的 合适的内切酶位点 相应的宿主细胞,48,基因克隆用细菌,提取载体质粒DNA,质粒DNA,质粒是细菌染色体外双链环状DNA,是基因工程最常用的
17、载体之一。,载体的分离,49,1. 对目的基因DNA和载体DNA进行酶切修饰,目的DNA,限制性核酸内切酶,质粒DNA,基因克隆的载体,酶切后的质粒示意图,三、目的基因与克隆载体的连接,50,酶切后的质粒DNA,同种限制酶酶切目的基因和载体,产生相互对应的粘性末端,退火后以DNA连接酶共价互补连接。,2. 目的基因连接到载体的过程,51,52,粘性末端 同一限制酶切位点连接 不同限制内切酶位点连接 同聚物加尾连接 人工接头连接 平端连接 黏-平末端连接,53,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制酶切位点连接,54,不同限制酶切位点(非配伍末端)的连接,Eco R切割位点,B
18、g l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 重组效率和特异性均好。,55,同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下,在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端,再进行粘端连接。,人工接头(linker)连接 在目的基因平端加上化学合成的含有一种或一种以上酶切位点的平端双链寡核苷酸片段,再用限制酶切除产生粘性末端,而进行粘端连接。,Biochem, JL Gu. 2007,56,平端连接,57,黏-平末端连接,目的基因插入载体可通过一端为黏端,一端为平端的方式得到重组子。优点:目的基因定向插入,避免自身环化。缺点:连接效率低,58,
19、受体菌条件 安全宿主菌 限制酶缺陷菌株(R-)和重组缺陷(Rec-) 处于感受态(competence),导入方式 重组DNA导入大肠杆菌-转化 (CaCl2转化法, 电穿孔法, 体外包装感染法) 重组DNA导入哺乳动物细胞-转染 (DNA-磷酸钙共沉淀, 病毒感染法, 显微注射法,脂质体介导法 ),四、重组DNA导入宿主细胞扩增,59,重组质粒,细 菌(CaCl2处理),细 菌(CaCl2处理),质粒导入未成功,质粒导入成功,转化过程中,首先要将对数生长期的细菌用冷(4)CaCl2处理,改变细胞膜的通透性,使细菌处于容易吸收外源DNA的状态感受态细胞。然后,在42进行热冲击(90秒),将质粒
20、导入细菌内.但不是所有的细菌中都能同时成功地导入质粒.因此产生两种状态的细菌:含有质粒的细菌和不含有质粒的细菌。,60,脂质体介导法:用人工合成的脂质膜包裹袋转化的DNA,形成脂质体结构,与受体细胞膜发生融合。,61,五、重组体的筛选与鉴定,筛选含有目的基因的阳性克隆 筛选含有载体的克隆 筛选含有正确重组体的克隆 筛选带有特异目的基因的克隆,62,含质粒的细菌,不含质粒的细菌,含有抗生素的培养基,由于质粒本身能够编码产生分解抗生素的酶,因此,凡是转化成功的细菌就能够在含有抗生素的培养基中生长。,含质粒的细菌(自身环化),含有质粒者才能生存,-筛选出含有质粒的细菌克隆,抗生素抗性筛选,63,插入
21、失活法,-筛选出含有重组体的细菌克隆,抗生素抗性筛选,64,互补(-complementation),载体lacZ编码-半乳糖苷酶的氨基端片段 宿主菌lacZ编码-半乳糖苷酶的羧基端片段,均无活性,各自编码的肽链可以融为一体,形成具有-半乳糖苷酶活性的蛋白。 -半乳糖苷酶可使特异性作用物变成蓝色化合物,遗传标志补救筛选: 标志补救(marker rescue),克隆的基因若能在宿主菌表达,且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补,可利用营养突变菌株筛选。,65,5-嗅-4-氯-3-吲哚- -半乳糖苷 (含底物X-gal培养基,无色),蓝色菌落,-半乳糖苷酶 异丙基硫代-D-半乳糖(诱导剂IPTG),白
22、色菌落,互补,66,互补,重组体,质粒,67,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,免疫化学法(略),68,存活的含有质粒的细菌菌落,大量生长的细菌,质粒 提取,含目的DNA,无目的DNA,酶切鉴定,获得含有目的基因DNA的重组质粒和菌种,重组体的鉴定:利用限制性内切酶的切割来鉴定质粒中是否有目的基因DNA,69,指被克隆入某一载体中的目的基因,经转录和翻译后产生蛋白质的过程。 核心是构建合适的表达体系: 表达载体的构建 受体细胞的选择 表达产物的分离纯化,原核表达体系 :原核基因,真核基因(cDNA) 真核表达体系 :真核基因,第四节 克隆基因的表达,70,E.coli表达体系最为常用 标准:选择标志
23、强启动子 翻译调控序列 合理设计的多克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA(只能表达真核生物目的基因的cDNA ) 不能加工表达真核蛋白质(缺转录后及翻译后加工) 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白,一、原核生物表达体系,71,哺乳动物细胞的表达载体常由动物病毒改造 真核表达体系常用酵母、昆虫、哺乳类动物细胞 优点: 可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达分泌型蛋白,有利于下游操作 缺点: 操作技术难、费时、不经济 (基因转移困难,整合位置和拷贝数难控制,表达 水平低),二、真核生物表达
24、体系,72,73,第五节 基因工程的下游技术,基因工程菌的发酵培养:方式、参数、发酵罐 目的蛋白的分离纯化:难度最大 目的蛋白的分析鉴定:产品鉴定、浓度、纯度、活性,74,第六节 基因工程技术的意义,一、促进对遗传信息的认识,人类基因组DNA约有2.85109bp,约2.5万个基因 已知的人基因只占估计数的百分之几 对表达调控了解很少 对非蛋白质偏码序列了解甚少,75,DNA重组技术,76,二、生产药物与疫苗,基因工程疫苗,使用DNA重组生物技术,把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中,使之充分表达,经纯化后而制得的疫苗。 应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位
25、疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗。如把编码乙型肝炎表面抗原的基因插入酵母菌基因组,制成DNA重组乙型肝炎疫苗;把乙肝表面抗原、流感病毒血凝素、单纯疱疹病毒基因插入牛痘苗基因组中制成的多价疫苗等。,77,基因工程肽类药物,78,基因工程抗体,79,三、制造转基因动物和植物,在其基因组内稳定地整合外源基因并能遗传给后代。,遗传育种 建立人类疾病的动物模型 治疗人类疾病的蛋白 提供健康的器官,转基因动物:,1994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场 1996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产 到1996年全世界已有250万公顷土地种植转基因植物,转基因植物:,抗植
26、病、抗虫、抗病毒和抗除莠剂 提高产量 改进质量,81,(一)疾病基因的发现,(二)发展生物制品,1、人类基因组计划 human genome project,HGP,2、脆性X综合症,1、蛋白质 EPO、生长因子、胰岛素、 干扰素、乙肝疫苗,2、转基因食品,3、生物克隆,四、用于基因诊断与基因治疗(略),82,(四)基因治疗 gene therapy,(五)遗传病的预防,(三)DNA诊断 DNA diagnostics,1、基因芯片,2、法医鉴定,3、亲子鉴定,转基因,1、产前检查,2、疾病预测,思考?,转基因植物有潜在的危险吗?如果有,可能在那几个方面? 如何对转基因食品作安全性评估? 如果
27、有选择,你更愿意吃天然的植物还是转基因植物? -,84,练习题,1、 限制性核酸内切酶切割DNA后产生 A、5磷酸基和3羟基基团的末端 B、5羟基基团和3磷酸基的末端 C、5磷酸基和3磷酸基的末端 D、5羟基基团和3羟基基团的末端 E、以上都不是,85,2、在下述双链DNA序列中不属于完全回文结构的是 A、AGAATTCA B、TGAATTCA C、GGAATTCC D、CGTTAACG E、AGATATCT 3、不能用作克隆载体的DNA是 A、质粒DNA B、噬菌体DNA C、细菌基因组DNA D、腺病毒DNA E、逆转录病毒DNA,86,4、下列关于限制性内切酶的叙述哪一项是错误的? (
28、) A它能识别DNA特定的碱基顺序,并在特定的位点切断DNA B切割点附近的碱基顺序一般呈回文结构 C它能专一降解经甲基化修饰的DNA D是重组DNA的重要工具酶 E主要从细菌中获得,5、从带有遗传信息的mRNA构建DNA重组体,要利用( ) A质粒 B限制性核酸内切酶 CDNA连接酶 D反转录酶,87,6、基因工程的主要内容包括 ( ) A载体和目的基因的分离 B限制性内切酶的切割,并把载体和目的基因合成重组 CDNA重组体的转化表达 DDNA重组体的扩增、筛选与鉴定;,基本概念: 基因重组、基因工程、限制性核酸内切酶、载体、质粒 问题:1、简述基因工程的操作基本流程 2、DNA重组中如何选
29、择合适的限制性核酸内切酶,并在此基础上选择合适的连接方式。 3、简述重组体筛选的蓝白斑实验的基本原理,88,James Watson and Francis Crick,1953年首次提出DNA双螺旋结构模型,生物学发展进入分子水平。,重组DNA技术的建立和发展,89,重组DNA技术的建立和发展,1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具,90,1972年重组出第一个人工DNA分子(SV40-),使其在大肠杆菌中成功表达,被誉为“重组技术之父”,荣获1980年诺贝尔化学奖,重组的SV40二聚体的构建 (引自 Berg et. al,1972),P. Berg,重组DNA技术的建立和发展,91,1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂,1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物,重组DNA技术的应用,92,重组DNA技术的建立和发展,1973年,Stanley Cohen 等将体外获得的重组基因(四环素抗性和新霉素抗性)导入大肠杆菌并成功扩增。 宣告基因工程诞生,S. Cohen,93,1997年英国罗斯林研究所成功的克隆了多莉羊,重组DNA技术的应用,克隆羊“多莉”与研究者伊斯维姆.穆特,
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