第7章_第2节_PCR技术(3_LMJ).ppt
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1、基因操作,第七章,Gene Manipulating,2019年6月22日10时2分,1,第二节,PCR 技术的原理与应用 Polymerase Chain Reaction,江黎明 2013年10月,2019年6月22日10时2分,2,PCR(polymerase chain reaction)技术是1985年由美国科学家Kary B Mullis发明的体外基因片段扩增的方法。,一、PCR技术的产生,2019年6月22日10时2分,3,PCR技术的创建,Kary B. Mullis(穆利斯(美),1971年,Khorana等提出在体外DNA经变性,与适当引 物杂交后用DNA聚合酶延伸,克隆D
2、NA的设想。,1983年,Mullis发明了PCR技术。,1988年,Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入PCR技。,1989年,美国Science杂志列PCR 为十余项重大科 学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年。,1993年,Mullis荣获度诺贝尔化学奖。,2019年6月22日10时2分,4,二、PCR技术的基本原理,DNA模板变性 (denature):,95左右高温使模板DNA完全变性。,单链DNA模板与引物退火 (annealing):,55左右引物与模板形成复合物的几率DNA分子自身的复性。,引物的延伸 (extension):,72左右耐热DNA聚合酶在最适温度下催
3、化DNA合成反应。,2019年6月22日10时2分,5,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR技术的基本原理示意图,Taq酶,Taq酶,2019年6月22日10时2分,6,2019年6月22日10时2分,7,PCR体系的5种基本组成成分,2019年6月22日10时2分,8,PCR反应循环,变性 9395C左右,延伸 酶最适温度,退火 引物Tm-5C,经过30个左右的循环后,模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。,2019年6月22日10时2分,9,思考题 1,PCR技术的主要特点,1.特异性强,2.灵敏度高,3.简便快速,4.对标本的纯度要求低,
4、2019年6月22日10时2分,10,衡量PCR好坏的参数:,特异性Specificity:最好只有目的DNA带。,真实性Fidelity:DNA序列正确。,产量Quantity:DNA带明亮。,2019年6月22日10时2分,11,思考题 2,利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模 板获得已知目的基因片段。,利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中 获得具有一定同源性的基因片段。,利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中 随机克隆基因。,用不同引物进行PCR获取目的基因:,三、PCR技术的主要用途及其衍生技术,(一)目的基因的克隆,2019年6月22日10时2分,12,(reverse
5、transcription PCR,RT-PCR),1.反转录PCR技术,特点:敏感度高、特异性强、省时等。,RT-PCR是从组织细胞中获得目的基因、对已知 序列RNA进行定性及半定量分析最的有效方法。,总RNA (或mRNA),ss-cDNA,ds-cDNA,PCR扩增,2019年6月22日10时2分,13,获取目的基因的特殊PCR技术:,RT-PCR原理,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,
6、PCR,大量的产物,2019年6月22日10时2分,14,RT-PCR的结果举例,2019年6月22日10时2分,15,gt10/11系列 (插入型,适用于cDNA克隆),6/22/2019 10:02 PM,16,重组噬菌体,锚定PCR,末端核酸转移酶,先合成第一链cDNA后,添加一同聚物尾(polydG),与带有polydC 限制性内切位点的3锚定引物一起扩增。,2019年6月22日10时2分,17,原理:,设计“内、外” 两对引物:,2.巢式-PCR(nested-PCR),先用外引物进行PCR反应,从模板上扩增出含有内引物扩增的靶序列的较长产物,并以此作为模板用内引物进行第二次PCR反
7、应,扩增出内侧的较短靶序列。,外引物对应的序列在模板的外侧; 内引物对应的序列在外引物的内侧。,2019年6月22日10时2分,18,第1轮PCR:1520个循环的标准扩增。,第2轮PCR:将第1轮PCR扩增产物稀释1001000倍, 作为模板进行第2轮PCR ,扩增1520个循环。,2019年6月22日10时2分,19,降低了多个靶位点扩增的可能性,因与2套引物都互补的靶序列很少。如用相同引物对作总数相同的循环,会扩增非特异性靶点。,可增加有限量靶序列(如稀有mRNA)的灵敏度,并且提高了困难PCR(如5 RACE)的特异性。,用外、内2对引物扩增,可大大提高扩增的灵敏度和特异性。,2019
8、年6月22日10时2分,20,3.cDNA末端快速扩增,2019年6月22日10时2分,21,3-RACE,2019年6月22日10时2分,22,5-RACE,5-cap,AAAAAAAAAA3,mRNA,GSP1,1.逆转录,去除RNA和GSP1,2.末端转移酶,3CCCCC,3CCCCC,3.退火,PCR,GSP2,5GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3,Xho l Sal I ClaI,3. PCR,用限制性内切酶切割克隆即获得5末端片段,2019年6月22日10时2分,23,2019年6月22日10时2分,24,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,4.反
9、向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,2019年6月22日10时2分,25,电泳,*2,3双脱氧核苷酸,*用4种不同荧光标记,DNA样品 引物、DNA聚合酶、dNTP,A,A,C,G,T,G,G,A,C,T,末端合成终止法测定DNA序列的原理,DNA自动测序结果,2019年6月22日10时2分,27,The Nobel Prize in Chemistry 1980,“for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, wit
10、h particular regard to recombinant-DNA“,“for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids“,Paul Berg,1/2 of the prize,Stanford University Stanford, CA, USA,1926 -,Walter Gilbert Frederick Sanger,1/4 of the prize 1/4 of the prize,Harvard University, Biological L
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