第7章_第4节_分子杂交和印迹技术(3_LMJ).ppt
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1、基因操作,第七章,Gene Manipulating,2019年6月22日10时2分,1,2019年6月22日10时2分,2,第四节,分子印迹与杂交技术,Molecular Blotting & Hybridization Technology,江黎明 2013年10月,指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链,在一定条件下按照碱基互补配对的原则,形成核苷酸双链的过程。,核酸分子杂交(nucleic acid hybridization),印迹(blotting),指利用各种物理方法,使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上,使之成为固相化分子的过程。,2019年6月22日10
2、时2分,3,Marmum和Doty1961年发现的DNA变性复性现象是核酸杂交技术的理论基础。,(heteroduplex),2019年6月22日10时2分,4,一、印迹技术(blotting),1975年Edwen Southern建立的DNA印迹杂交。,指将电泳凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质如硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。,转移缓冲液,纸巾,玻璃板,(1)印迹:,电转移,真空负压吸引转移,Whatman滤纸,凝胶,Whatman滤纸,重物,NC膜或尼龙膜,毛细作用转移,2019年6月22日10时2分,5,NC膜上载有的DNA单链分子就可以在杂交液中与另一种DNA或RNA分
3、子(称为探针,可用同位素或非同位素标记)进行杂交。,具有互补序列的RNA或DNA标记探针结合到存在于NC膜的DNA分子上,经放射自显影或其他检测技术就可以显现杂交分子的有无和位置。,(2)杂交:,(3)显示:,2019年6月22日10时2分,6,(1)特定基因序列的定性和定量分析,核酸分子杂交应用,(2)基因克隆的筛选,(3)酶切图谱的制作,(4)基因突变分析,(5)疾病的诊断,2019年6月22日10时2分,7,二、探针的种类和制备,探针(probe)的概念:,用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA或RNA的互补标记片段:,与待测特定核苷酸的某一段序列相互补;,有明确的标志用于后续的检
4、测。,2019年6月22日10时2分,8,探针的种类,寡核苷酸探针,基因组DNA探针,cDNA探针,RNA探针,(一)常用探针的种类,DNA探针,2019年6月22日10时2分,9,1DNA探针,双链探针:,单链探针,从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备;优点则是容易制备。,用化学法合成或从克隆在M13噬菌体的特异性基因片段制备;优点是在杂交反应中可以排除互补链的干扰。,2019年6月22日10时2分,10,2RNA探针,早期采用细胞mRNA和病毒RNA作探针,主要用于研究目的,而不是用于检测。如筛选HIV的基因组DNA克隆、进行中的转录分析等式。,与DNA单链探针相比,RNA探针具有标记效
5、率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点,标记是在细胞基因转录或病毒复制过程,效率往往不高,且受多种因素的制约。,2019年6月22日10时2分,11,(二)核酸探针的标记,根据是否使用放射性标记物可分为放射性标记和非放射性标记;根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。,理想标记物 应备条件,不影响碱基对特异性,有较高的化学稳定性,检测方法高度特异、灵敏,标记及检测方法简单,环保,无损害,价格低廉,2019年6月22日10时2分,12,优点,缺点,灵敏度和特异性极高,半衰期短, 随用随标,1.放射性同位素标记探针,对各种酶促反应无任何影响,不影响碱基配对的特异性与稳定性,放射性污染,用
6、于核酸探针标记的放射性同位素主要有32P、3H和35S等;32P应用最多。,2019年6月22日10时2分,13,32P的放射性较强,放射自显影所需时间较短,灵敏度高,可广泛应用于各种印迹杂交。,缺点是半衰期短(14.3天),射线散射严重,放射自显影后X胶片上的信号有时边缘不清。,r-32P ATP,a-32P dATP,*,*,3,H,2,dATP,2019年6月22日10时2分,14,当双链DNA一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶的53聚合酶活性可将核苷酸连接到切口的3羟基末端;同时,53的外切酶活性能从切口的5端除去核苷酸。,最适切口平移的片段一般为50-500个核苷酸。,(
7、1) DNA切口平移(nick translation) 标记法,在切去切口5端核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,可使切口沿着DNA链移动;用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,将放射性同位素掺入到合成新链中。,2019年6月22日10时2分,15,核酸探针的标记方法,DNA酶:在双链DNA上随机打开若干个单链缺口,产生3-OH端。,大肠杆菌DNA聚合酶:53 DNA聚合酶活性; 53 外切核酸酶活性。,DNA切口平移标记法示意图,2019年6月22日10时2分,16,使寡核苷酸随机引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。,合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中
8、模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。,(2) DNA随机引物标记法,2019年6月22日10时2分,17,随机引物:含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096,DNA聚合酶Klenow片段:保留53 DNA聚合酶活性,弱35外切酶活性,无53外切酶活性。,DNA随机引物标记法示意图,2019年6月22日10时2分,18,优点:,Klenow片段没有53外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针;,对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应;,产物的比活性较高,可达4109 cpm/g探针;,随机引物反应还可在低熔点琼脂糖中
9、直接进行。,2019年6月22日10时2分,19,完整双链DNA,-32P-dNTP,其他3 种dNTP,5 末端突出的DNA,3 末端标记的DNA,32P-末端标记的单链DNA探针,1) DNA的3末端标记,(3) DNA的末端标记,2019年6月22日10时2分,20,条件是有5-OH存在,人工合成寡核苷酸最常用;双链DNA需用碱性磷酸酶切除5-P后再标记,5pCpGpTpA3,5HO-CpGpTpA3,T4噬菌体多核苷酸激酶,-32P-ATP,532p-O-CpGpTpA3,37,反应10min, -32P-ATP 需150 ci/反应,2) DNA的5末端标记,碱性磷酸酶,2019年6
10、月22日10时2分,21,标记探针的纯化,凝胶过滤层析,常用的凝胶基质:Sephadex G-50、Bio-Gel P-60,选择性沉淀,乙醇存在,醋酸铵可起此作用。,2019年6月22日10时2分,22,核酸探针的标记方法,(1) DNA切口平移标记法,(2) DNA随机引物标记法,(7) RNA探针的标记,(3) DNA的末端标记,(4) cDNA探针的标记,(5) 寡核苷酸探针的标记,(6) 单链DNA探针的标记,2019年6月22日10时2分,23,2. 非放射性标记物,优点,缺点,灵敏度较放射性同位素标记低,无放射性污染,用于核酸探针标记的非放射性标记物主要有生物素、地高辛和荧光素(
11、FITC、罗丹明)等。,稳定性好,可较长时间存放,特异性较放射性同位素标记低,2019年6月22日10时2分,24,2019年6月22日10时2分,25,The method used to produce nonradioactive DNA molecules that carry a specific chemical marker that can be detected with an appropriate antibody.,biotin-avidin system,Dig-dUTP,HRP/AP标记抗体与Dig结合,漂洗和封闭,底物与抗体-HRP /AP反应, 显色或发光,底物
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- 分子 杂交 印迹 技术 _LMJ
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