第7章_第6节_生物芯片技术(3_LMJ).ppt
《第7章_第6节_生物芯片技术(3_LMJ).ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第7章_第6节_生物芯片技术(3_LMJ).ppt(62页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、江黎明 2012年10月,生物芯片技术,第十四章,Biochip Technology,医学分子生物学实验技术药立波 主编,第一节 概 述,一、生物芯片的概念,二、DNA芯片,一、基因表达谱研究,一、原位合成DNA芯片制作,二、DNA微阵列芯片制作,一、待测样品的准备,二、分子杂交反应,三、检测分析,第二节 生物芯片的制作,第三节 DNA芯片使用的基本流程,第四节 蛋白质芯片,第五节 生物芯片的基本操作和流程,二、DNA测序,三、基因突变检测,四、基因诊断,五、蛋白质芯片的应用,六、药物研发,目 录,2019年6月22日10时2分,2,生物芯片(biochip) 技术是20世纪90年代初期由分
2、子生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而发展起来的高新技术,因既具有重大的学术价值,又具有明显的产业化前景,被评为1998年度世界十大科技进展之一。,生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。,生物芯片将会改变生命科学的研究方式,革新医学诊断和治疗,极大地提高人口素质和健康水平。,第一节 概 述,萨瑟恩提出的核酸杂交理论,即标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交。,(Edwin Mellor Southern),Southern杂交可以被看作是生物芯片的雏形。,2019年6月22日10时2分,5,桑格和吉尔伯特发明了现在广泛使用的D
3、NA测序方法,并由此在1980年获得了诺贝尔奖。,(Frederick Sanger ),(Walter Gilbert),生物芯片这个概念首先是由Fred Sanger和Walter Gilbert提出的;解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、低通量等不足。,2019年6月22日10时2分,6,1989,Stephen Fodor(斯蒂文弗尔多) 发明了高密度生物芯片和芯片阅读器,为生物芯片产业开创及发展奠定了良好的基础。,1992,Affymatrix公司Fodor小组运用半导体照相平板技术,对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道,这是世界上第一块基因芯片。,2019年6月22日1
4、0时2分,7,1995,Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片;将cDNA密集点样在玻璃片上,进行基因表达谱研究和SNP分析。,2019年6月22日10时2分,8,一、生物芯片的概念,指通过微电子和微加工技术,将大量已知序列的核酸或蛋白片段等,有序地组合在1CM2大小固相介质表面而构成的集成分析系统。可与标记的核酸或蛋白分子特异结合,实现对核酸、蛋白等生物组分的快速、高效、敏感的处理与分析。,狭义的生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等。,广义的生物芯片还包括用于研制生物计算机的生物芯片、将健康细胞与电子集成电路结合起来的仿生芯片、缩
5、微化的实验室即芯片实验室。,2019年6月22日10时2分,9,生物芯片的基本原理与特征:,“芯片” 特征:,“分子杂交”原理:,生物分子间的相互特异识别作用(如: DNA分子之间、蛋白分子之间、DNA与蛋白分子之间以及自组装单分子膜之间等),高通量、高集成、并行化、微型化、自动化、连续化,2019年6月22日10时2分,10,根据芯片的用途可分为两大类,2019年6月22日10时2分,11,二、DNA芯片,又被称为基因芯片 (gene chips)、DNA阵列(DNA array)、cDNA芯片(cDNA chips)、寡核苷酸阵列(oligonucleotide array)等。,DNA芯
6、片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先合成的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面;,使用时与标记的样品杂交,通过对杂交信号的检测分析从而得出样品的遗传信息。,2019年6月22日10时2分,12,1. 玻片型 这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的,点阵密度很高,所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。,2019年6月22日10时2分,13,有此类产品研制能力的公司不多,如Affimetrix公司。,(一)从支持物来分主要有:,2. 薄膜型 如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。这种类型“芯片”的点阵是通过“点膜”形式制作的,并通过一定的方法使探针能够牢固地
7、结合于其上,整个过程类似于斑点杂交技术(如Clone Tech公司)。,2019年6月22日10时2分,14,3. 微板型 这种芯片实质上是一种具有高密度、小容量测试孔的小型酶联免疫检测板(如PE公司等)。,2019年6月22日10时2分,15,4.集成电路型 将杂交技术与微电子技术结合于一体,通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程(如Nanogen公司),2019年6月22日10时2分,16,(二)根据制作方式可分为两大类:,2019年6月22日10时2分,17,原位合成芯片 (synthetic genechip) DNA 微集阵列( DNA microarray),基因芯片的
8、制作方式,原位合成,直接点样,显微光蚀刻技术(光引导原位合成),分子印章法,分子印章法,针式点样,喷墨点样,压电打印法,2019年6月22日10时2分,18,第二节 生物芯片的制作,一、原位合成DNA芯片的制作,(一)显微光蚀刻技术,支持物经化学处理, 表面活性羟基(OH)连接光敏保护基(X), 选用光刻掩模(M1)保护非聚合部位;,2. 用激光点光源照射聚合部位,去除光敏保护基(X), 暴露活性羟基(OH);,3. 加入单核苷酸(如dTMP)的亚磷酰胺活化端与活性羟基(OH)发 生化学偶联 ,光敏保护非活化端;,4. 更换掩模(M2),激光点光源照射下一个位点;,5. 脱保护,偶联第二个核苷
9、酸(如dCMP);,6. 重复上述步骤,直至合成完所需探针。,2019年6月22日10时2分,19,合成过程,光刻掩模1,光刻掩模2,(一)探针的设计与制备,DNA 微集阵列探针可用人工合成寡核苷酸、基因组DNA或cDNA中的目的基因片段;可为双链DNA、单链DNA或 RNA,亦可用肽核酸(PNA)等。,二. DNA微集阵列芯片的制作,肽核酸( peptide nucleic acid , PNA),是一类以氨基酸替代糖-磷酸主链的DNA类似物,骨架由重复的N-甘氨酸通过酰胺键相连构成,碱基则通过甲叉碳酰基与骨架相连。,PNA分子内不会形成二级、三级结构;DNA与PNA杂交不需要盐离子。,20
10、19年6月22日10时2分,21,探针制备:,常规分子生物学技术(如基因克隆、PCR、RT-PCR、化学合成等)。,探针的纯化:,探针的选择:,cDNA探针用于基因表达谱分析;寡核苷酸探针用于基因突变检测。,阳性对照 阴性对照 空白 对照,脱盐、除酶及去除过剩的DNA等。,DNA芯片探针,实验组探针,对照组探针,2019年6月22日10时2分,22,固相支持物分为实性材料和膜性材料两类:,最常用的玻片预处理方法:,实性材料有硅芯片、玻片和瓷片等;膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜和硝酸纤维膜。,(二)支持物的类型与预处理,2019年6月22日10时2分,23,采用多聚赖氨酸包被,氨基硅烷化,醛基化等方
11、法,使其表面衍生出氨基或醛基 。,1.喷墨打印,将合成用探针溶液放入打印墨盒内,由电脑依据预定的程序在 xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动,并将特定的探针试剂喷印到特定位点。,喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。,(三)探针的打印,2019年6月22日10时2分,24,1)玻璃片基的处理:使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团;,优点:成本低,操作简单,密度高 (几十万点 cm2), 转移过程中探针溶液损失小。,2.针式打印,缺点:定量准确性、重现性不好。,2)点样针沾取探针溶液;,3)点样针把探针点到玻片表面,让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。,
12、2019年6月22日10时2分,25,2202芯片点样仪 生 产 商:Bio-Rad; 性能介绍:分辨率:1.25um(x,y轴)和0.25um(Z轴)。 重复性:3um;球面精确性:l0um。 一次制成芯片数:126块芯片,每块玻片点样量82,000个点。,2019年6月22日10时2分,26,氨基修饰的玻片,可以一定能量的紫外线进行照射,使 DNA探针中的胸腺嘧啶残基,与支持物上带正电的氨基形成共价键而固定在玻片表面;,醛基修饰的玻片,可使氨基末端修饰探针的氨基,与玻片上的醛基形成 Schiff碱,使DNA探针固定在玻片表面。,(四)探针的固化,2019年6月22日10时2分,27,一、待
13、测样品的制备,用PCR或反转录法标记时,可用荧光标记底物(dNTP), 也可标记引物的5末端。,第三节 DNA芯片使用的基本流程,双色荧光标记: 待测样品用Cy3;对照用Cy5。,常用于标记的荧光分子有:Cy3、Cy5、FITC、TRITC 和生物素等。,组织细胞或其他材料,提取,核酸,纯化,纯核酸,核酸,纯化,随机引物延伸、PCR 或反转录标记,2019年6月22日10时2分,28,类型:固-液相杂交(固相:探针;液相:靶核酸)。,特点:探针的数量 靶基因的数量,反应动力学:呈线性关系,信号强度 (样品)靶基因的量,空间位阻效应:探针 靶分子;探针 探针,2.杂交反应条件优化,PNA分子内无
14、带负电荷的磷酸基团。,1.芯片杂交的特点:,3.Nnogen公司研制出的电子基因芯片。,二、分子杂交反应,2019年6月22日10时2分,29,检测芯片荧光信号有两类仪器:,1、利用电荷偶合装置检测的摄像仪; 2、激光共聚焦扫描仪。,所谓激光共聚焦,是指激发光路和发射光路分别在两个位置上聚焦。,应注意如何有效防止来自杂质的荧光信号,提高信/噪比。,三、检测分析,2019年6月22日10时2分,30,(入射) 激光束,发射光滤镜,检测透镜,检测器,共聚焦 针孔,荧光束,光束分离器(分光镜),物镜,支持物,由样品发射的荧光,图14-4 共聚焦扫描示意图,反光镜,样品,放大器,数模转换器,计算机,2
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 生物芯片 技术 _LMJ
链接地址:https://www.31doc.com/p-3003468.html