02-PCR技术原理及其应用-刘晓雪.ppt
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1、第二章 PCR技术原理及其应用,第一节 PCR技术原理,PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合链式反应 Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. Peoples Choice Reaction,一、PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,8,Kary Mullis(1985) 发明
2、过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇,可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下,即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 发展过程: 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段,该酶不耐热,每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。,PCR技术简史,DNA的复制 聚合酶链反应的发明,Kary B. Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,引物,引物,Mullis
3、的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,12,专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年,DuPont异议,大小公司对簿公堂,将决定谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是,1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明,并公布于众,应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg(研究DNA聚合酶获诺贝尔奖)也认为,任何具备生物技术知识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。 美国专利局驳回DuPont异议,地方法院判属Cetus。Cetus获胜后马上反诉,指出DuPont已侵犯另一项与PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂和仪器。,13
4、,根据ABI(美国应用生物系统公司)和Roche(罗氏)的协议,PCR专利可分为方法专利和仪器专利,ABI得到仪器专利,Roche掌握方法专利。 在应用领域,Roche的势力范围是诊断、亲子鉴定、兽医;ABI争到的领地包括研发,质控、法医、环境、农业等。 对于科研人员来说,主要关注的是科研领域也就是ABI的领地。 PCR专利意味着什么?所有科研用途的仪器或者试剂的生产商在生产销售PCR相关产品时需要上缴专利使用费给ABI,ABI平均每年获得的5千万美元PCR专利版税的来源。,Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90
5、100,100 80 60 40 20,72,94,55,PCR循环,二、PCR的基本原理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC),Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性:模板DNA
6、经加热至93左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;,PCR Cycle - Step 3 -
7、 At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链。,End of the 1st PCR Cycle Results
8、 in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需24分钟, 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,Target Amplification,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16
9、 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,三、PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR仪,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 P
10、CR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的
11、特点,以DNA为模板的反应 反应体积:50100l 缓冲液 引物 底物:4种dNTP 模板:102105拷贝 TaqDNA聚合酶 矿物油,四、PCR反应体系,以mRNA为模板的反应(逆转录PCR) 逆转录反应体系 体积:20 l 缓冲液 底物:4种dNTP 引物:oligo(dT)1218 模板:RNA 逆转录酶 其他试剂:RNA酶抑制剂, MgCl2.DTT.牛血清白蛋白 PCR反应体系同以DNA模板的反应体系,1)PCR反应成分,(1)模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的
12、非特异性增加。,(2)引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过低影响产量,偏高引起错配和非特异性产物增加,且可增加引物二聚体的产生几率。 (3)Taq DNA聚合酶(thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,(4)dNTP 20200mol/L dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量,但特异性增加 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,(5) Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L
13、-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降; Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,1050mmol/L Tris-Cl 缓冲液,72 时pH7.2,调节反应体系的pH值,使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火,大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。,(6) PCR反应的缓冲液,2)循环参数 变性 94oC95oC 30-60秒 且最初在加Taq酶之前先于9
14、7oC充分变性510min (2) 退火 50oC55oC 60-90秒 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。,(3)延伸 70oC74oC 60-120秒 延伸时间由扩增片段长度决定 (4)循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多:非特异扩增增加,(五)PCR产物的积累规律,在PCR反应中,DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期,目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累,扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态,即出现“停滞效应”,又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效
15、率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前,TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。 多数情况下,平台期在PCR反应中不可避免。,PCR产物的积累规律示意图,(一)一般原则 引物长度在1530碱基。引物过短,会使特异性降低。过长会提高相应的退火温度,且合成引物的成本增加。 引物中碱基的分布是随机的,避免4个以上的嘌呤或嘧啶的连续排列,G+C含量宜在 4555左右。,五、PCR引物的设计,避免两引物间的互补,特别是3端互补,以免形成二聚体。 引物自身不应存在连续超过3bp的互补序列, 否则引物自身会折叠成发夹结构或引物本身变性。,引物的3端不能有任何修饰,也不
16、能有形成任何二级结构的可能。 引物的5端限定着PCR产物的长度,可根据产物的要求不同, 可以选用不同的引物修饰法。,引物与非扩增序列的同源性不应超过70。,直接提交模板序列到特定网页。 如:http:/genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer; http:/frodo.wi.mit.edu/ 引物设计软件。功能:首先是引物分析评价功能,其中以“Oligo 6”最为优秀;其次是引物的自动搜索功能,各种软件在这方面的侧重点不同。,(二)引物设计的方法,六、PCR产物的检测,(一)琼脂糖凝胶电泳 是PCR扩增产物的分离、纯化和鉴定最常用的方法。其
17、分辨率很高,可测出1ng DNA。一般800bp以上的片段用0.8%的胶,800bp以下的片段用1.0%2.0%的胶。,灵敏度比琼脂糖凝胶电泳高,主要用于分离制备小于1kb长度的低分子质量基因片段,因此特别适用于合成的基因片段的分离和检测。适用于PCR扩增效率低时产物的检测。根据扩增片段的大小选择合适的胶浓度,电泳后可用银染或溴乙锭染色检测,银染比EB染色检测灵敏度高210倍。,(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳,高效液相色谱(HPLC)是在常压基础上发展起来的一项现代化分析技术,其特点是分离速度快、效果好,是目前基因片段分离纯化所广泛采用的方法之一。 离子交换层析( IEC )的基础是溶质分子所携带的
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