第三章核酸.ppt
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1、第三章 核 酸,3.1 核酸是生命遗传的化学本质,1928年,英国 S型肺炎球菌:有荚膜,菌落表面光滑 R型肺炎球菌:没有荚膜,菌落表面粗糙,结果说明?,著名的肺炎球菌实验,结果说明:加热杀死的S型肺炎球菌中一定有某种特殊的生物分子或遗传物质,可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌 这种生物分子或遗传物质是什么呢?,纽约洛克非勒研究所 Avery 从加热杀死的S型肺炎球菌将蛋白质、核酸、多糖、脂类分离出来,分别加入到无害的R型肺炎球菌中, 结果发现,惟独只有核酸可以使无害的R型肺炎球菌转化为有害的S型肺炎球菌。 1944年 结论:DNA是生命的遗传物质,核酸分为两种:脱氧核糖核酸(D
2、NA)和核糖核酸(RNA) DNA兼具储存和传递遗传信息的双重功能 DNA复制 由DNA转录成RNA RNA携带的信息转录和表达成具有一定氨基 酸顺序的蛋白质,3.2 核酸的结构,3.2.1 结构单元,核酸是一种线形多聚核苷酸(polynucleotide), 其基本结构单位是核苷酸(nucleotide)。,核糖 组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-2 一脱氧核糖;RNA所含的糖则为-核糖,碱基 组成核酸的碱基为嘌呤和嘧啶的衍生物,共五种。两种是嘌呤碱的衍生物:腺嘌呤(Adenine,A)和鸟嘌呤(Guanine,G)。三种是嘧啶碱的衍生物:胞嘧啶(Cytosine,C)、胸腺嘧啶(Th
3、ymine,T)和尿嘧啶(Uracil,),腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,胸腺嘧啶,尿嘧啶,核苷 由核糖或脱氧核糖中C上的半缩醛羟基(构型)与嘌呤碱基的NH或嘧啶碱基的N一H脱水连接而成的化合物。糖与碱基之间的C-N键,称为CN糖苷键。X衍射分析证明,核苷中的碱基近似地垂直于糖的平面。,核苷酸 核苷中戊糖的羟基被磷酸酯化,即为核苷酸。,1、种类: 1)按酯化位点:可在核糖的2- , 3-, 5-; 2)按核糖类型: 核苷酸、 脱氧核苷酸,3.2.2 多聚核苷酸,核苷酸的5一磷酸基与另一分子核苷酸的C3一OH形成磷酸二酯键相连成链状聚合物。 两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键通常称为5-3磷酸二酯键。C5
4、端带有一个自由磷酸基,称为5一磷酸端(常用5一P表示);另一端3带有自由的羟基,称为3一羟基端(常用3一OH表示)。 多聚核苷酸链具有方向性,当表示一个多聚核苷酸链时,必须注明它的方向是5一3或是3一5。,在多聚核苷酸(DNA或RNA)链中,由于构成核苷酸单元的戊糖和磷酸基是相同的,体现核苷酸差别的实际上只是它所带的碱基,所以多聚核苷酸链结构用简式表示,3.2.3 DNA的结构,1953年,JWatson和FCrick在前人研究工作的 基础上,根据DNA结晶的x衍射图谱和分子模型, 提出了著名的DNA 双螺 旋结构模型.,要点(1)两条链反向平行,绕同一轴相互缠绕成右手螺旋;(2)磷酸和戊糖交
5、替处于螺旋外围,碱基处于内部,形成碱基对;(3) 双螺旋的直径为2nm,碱基堆积距离为0.34nm;(4)一条链的核苷酸序列可以决定另一条互补链的核苷酸序列。,双螺旋分子中糖分子与纵轴平行,与碱基平面垂直。,稳定双螺旋结构的作用力为氢键、碱基堆积力(即疏水作用)和环境中正离子的作用。,DNA的复制及其生理意义:,碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式进行。,DNA复制假说 组成双螺旋的两条链先拆分成单链 以DNA单链为模板合成与模板完全互补的新链,形成一个新的DNA分子,因为其中一条链来自亲代DNA,又称为半保留复制 DNA复制是生物遗传的最基本的分子机制,1958 年,科学家用
6、实验证实DNA复制理论的正确性。,DNA的三螺旋结构,1957年,Rich A用两条poly U和一条Poly A合成一种三链物质,提出了DNA的三螺旋结构。 DNA三螺旋结构与双螺旋结构相似,都是通过分子间氢键形成的: 组成DNA的单链一般是由单一的嘌呤碱和单一的嘧啶碱组成; 组成三螺旋有两种情况:嘧啶-嘌呤-嘧啶、嘌呤-嘌呤-嘧啶; 每条单链至少又8个核苷酸构成。,DNA分子的三螺旋结构: 在DNA分子中,镜像重复序列可以回折,形成三螺旋结构。 DNA的三螺旋结构在阻断基因转录和对DNA分子进行“分子切割”方面具有潜在的应用价值。,3.2.4 RNA的结构和分类,1. RNA的结构 组成:
7、4种核苷酸,AUCG; 连接:同DNA 形成:一般以DNA为模板合成, 有例外。 结构:单链线形分子,嘌呤碱 嘧啶碱; 局部区域有双螺旋结构, 配对不严格,G和C 也可以G和U配对; 不能形成双螺旋的部分 形成突环,2. RNA的类型,三种: 信使RNA(messenger RNA,mRNA):5%,是蛋白质 合成的模板; 转运RNA (transfer RNA,tRNA):15%,将mRNA携 带的信息翻译成氨基酸,且将相应氨基酸运送到 蛋白质生物合成的基地 核糖体RNA (ribosomel RNA,rRNA):80%,是组成 核糖核蛋白体的主要成分,3.3 嘌呤碱基和嘧啶碱基的性质和化学
8、反应,嘌呤碱基和嘧啶碱基的性质和反应性能对核酸的性质和生理功能有重要影响。 嘌呤碱基和嘧啶碱基具有弱碱性,在水中溶解度很小,转变成核苷酸后,溶解度大大增加。 嘌呤碱基和嘧啶碱基都为高熔点的无色晶体。,3.3.1 碱基的芳性和结构互变,x衍射分析证明,嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近 于平面的结构。碱基的芳香环与环外基团可以发生 酮式一烯醇式或胺式一亚胺式互变异构。,碱基环互变异构取决于介质的条件,影响最大的是 PH和温度。不同的氢键异构体形成氢键的能力和方 向差别很大,对核酸的立体异构影响很大。,3.3.2 碱基的碱性,嘌呤碱和嘧啶碱都具有弱碱性。杂环上碱基的PKa 值约为9.5,环外的胺基碱性很
9、弱,在生理条件下 不能质子化。,亲电进攻: 嘧啶环中C5位最为活泼,而嘌呤环中,C8位最活泼,3.3.3 嘌呤和嘧啶碱基的化学反应,卤代:,烃化:,2. 亲核进攻: 含氮杂环中,各个原子的电子云分布不等,在一定条件下也可以发生亲核加成反应。 水解反应: 含羰基的碱基在碱性条件下,酰胺键接受亲核试剂进攻,可以发生水解开环反应,与肼反应:此反应只发生在嘧啶碱,嘌呤碱不能发生此类 反应,在核酸分析中有重要的应用价值。,与羟胺反应:,尿嘧啶核苷与羟胺在pH=910条件下反应,将发生碱基开环分解反应。,3. 胺基的烷基化反应: 在一般烷基化条件下,含氮碱基的烷基化主要发生在杂环的氮原子上:,在温和的碱性
10、条件下,1-甲基腺嘌呤核苷可以发 Fisher-Dimroth重排,得到环外胺基的甲基化产 物。 若用CH2N2做烷基化剂,则所有含氮碱基都能发生烷 基化反应。,4. 环外胺基的反应: 环外胺基在适当条件下,也可发生化学反应。 亚硝酸有可能会改变DNA的碱基组成,引起基因突变。,次黄嘌呤核苷,黄嘌呤核苷,5. 环外氧原子的烷基化反应: 含有羰基的碱基可以异构化成烯醇式,若用烷基化试剂处理,可生成相应的烷基化碱基。 常用的烷基化试剂有:,甲基亚硝基脲,甲基乙基磺酸酯,N-甲基-N-亚硝基-N-硝基胍,与胞嘧啶配对,烷基化后与胸腺嘧啶配对,6. 光聚合反应: 如果两个胸腺嘧啶碱基相邻,在紫外光照射
11、下,可能发生二聚,破坏了DNA分子的复制功能。,7. 紫外吸收光谱: 含氮碱基都有大p键,在紫外区都有特征吸收。 核酸的最大紫外吸收在260nm,而蛋白质在280nm。,3.4.1 核酸的解离 多聚核苷酸含有两性基团(磷酸和碱基),解离情 况和蛋白质类似。 磷酸是中强酸,而碱基的碱性很弱,因此核酸的等 电点处于低pH值。 DNA的等电点是44.5,RNA的等电点是22.5,RNA 中的2-羟基能与磷酸中的羟基氧形成氢键,促进了 氢的解离。 可以利用等电点的不同区分DNA和RNA。,3.4 核酸的性质,3.4.2 核酸的水解,酸或碱水解 酸或碱可水解多聚核苷酸,例如0.1M NaOH即可将 RN
12、A完全水解,而相同条件下DNA不受影响,说明DNA 的碱水解比RNA困难得多。这种水解性能上的差别, 与RNA核糖基上2-OH的邻基参与作用有很大的关 系。 DNA和RNA水解稳定性上的明显差异具有重要的生物 学意义。,DNA水解,RNA水解,2. 酶水解 能够水解多聚核苷酸链中磷酸二酯键的叫做核酸水 解酶。根据水解对象可以把核酸水解酶分作DNA水 解酶(DNases)和RNA水解酶(RNases)。 根据作用方式又可将其分作两类:核酸外切酶和核 酸内切酶。 不同的水解酶水解产物不同。,双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶(restriction enzyme)切断, 又
13、可以再连接起来。切断的过程不需要能量,而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。这就是分子克隆和DNA重组技术的基础。,限制性内切酶,大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4 6 个碱基的palindrome 顺序。它们在微生物细胞内发挥的是防御外来DNA入侵的国防军的作用。,3.5.1 Maxam-Gilbert法 1975年, Maxam 和 Gilbert利用有机化学方法, 选择性地切断某种特定的核苷酸所形成的磷酸二酯 键,得到不同长度的小片段。此法又称为化学降解 法。 包括:碱基选择性水解 DNA小片段的电泳分析和碱基顺序推测,3.5 核酸碱基顺序分析中的化学反应,嘌呤碱和嘧啶碱残基在不同
14、条件下水解。 嘌呤碱先用硫酸二甲酯甲基化,而后用碱水解可水解磷酸二酯键。 嘧啶碱先用肼处理,而后用哌啶碱处理,即可切断相应的磷酸二酯键。 无论嘌呤碱还是嘧啶碱,水解位点上的含氮碱基均被破坏。 根据上面的原理,可以在不同条件下,选择性地切断分别由四种不同的核苷酸形成的磷酸二酯键,碱基选择性水解:,例如: ATTGACTTAGCC,ATT ACTTAGCC,ATTGACTTA CC,ATT ACTTA CC,6种核苷酸片段,Maxam-Gilbert法:,用放射性同位素32P标记末端的DNA片段,在5组互相独立的化学反应中分别得到部分降解,每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基,因而产生了5组放射
15、性标记的分子,从共同起点(放射性标记末端)延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置决定了DNA 分子的长度。然后,通过对各组进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,放射自显影检测末端标记分子。,所测核酸序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝 。 Maxam-Gilbert法只需要末段标记的DNA片段和人所共知的简单化学试剂。 Maxam-Gilber化学降解法所能测定DNA序列的长度要比Sanger法短一些,通常说来,化学降解法对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。,3.5.2 Sanger法:,1976年
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