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1、核 酸(II),理化性质和研究方法,核酸理化性质,一般理化性质 两性解离,一般为酸性 微溶于水,不溶于一般有机溶剂 DNA溶液粘度极高,RNA则小得多 化学反应 D-核糖与浓盐酸-甲基间苯二酚(苔黑酚)共热产生绿色,RNA测定反应 D-脱氧核糖与酸和二苯胺一同共热分成蓝紫色,DNA测定反应 光吸收性质 核酸在260nm处有强烈光吸收,可以通过OD260来定量分析核酸 1OD= 50g/ml双螺旋DNA, 40g/ml单链DNA(RNA),或20g/ml单核苷酸,OD260/OD280可以鉴别核酸的纯度,DNA为1.8,RNA为2.0 核酸的变性与复性 变性:核酸原有的碱基配对关系和高级构象被破
2、坏,成为无规线团,对DNA而言也指双螺旋的无规则拆分 变性后核酸性质的改变 光吸收增加,增色效应 粘度下降 浮力密度提高 生物学功能减弱或缺失 变性的因素 破坏氢键的因素 妨碍碱基堆积的因素 增加磷酸基静电斥力的因素,DNA热变性与Tm DNA的稀盐溶液加热到一定温度后,260nm的光吸收会骤然增加,增加幅度40%,表明DNA的热变性是一个突变过程。 熔解温度Tm:定义DNA热变性过程中,紫外光吸收增量到最大增量一半的温度为Tm 影响Tm的因素 核酸均一性:均一性愈高,熔解过程的温度范围愈窄 G-C对含量: G-C对含量越高, Tm越高,在1SSC溶液中,(G-C)%=(Tm-69.3) 2.
3、44。SSC溶液:0.15mol/L NaCl, 0.015mol/L柠檬酸钠 溶液离子强度:离子强度越低, Tm越低 溶液pH:高pH容易变性, pH低于5.0则容易脱嘌呤 变性剂:甲酰胺、尿素、甲醛,核酸的复性 变性核酸的高级构象在适当的条件下重新恢复的过程称核酸的复性,对DNA而言指双螺旋结构的恢复 热变性的DNA的复性过程,需要缓慢的冷却过程,也称退火 核酸复性过程中光吸收下降,称减色效应 影响核酸复性的因素 温度,复性温度不宜过低,一般以Tm-25C为宜。 核酸单链的浓度,一定范围内与浓度正相关 核酸长度,分子量大的复性慢 片段内重复序列多,易于复性 离子强度,一定的离子强度有利于核
4、酸复性 分子杂交: 在复性的过程中,不同来源的核酸片段,可能因具有互补片段而相互结合形成双链,称分子杂交,核酸的水解,核酸的酸水解和碱水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别 在0.1mol/L的NaOH溶液中,RNA几乎可以完全水解,生成2-或3-磷酸核苷;DNA在同样条件下则不受影响 这种水解性能上的差别,与RNA核糖基上2-OH的邻基参与作用有很大的关系,在RNA水解时,2-OH首先进攻磷酸基,在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯,再在碱的作用形成水解产物 酸易水解N-糖苷键,嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解 脱氧核糖比核糖的糖苷键易水
5、解,DNA的嘌呤碱在pH2以下即脱落而成无嘌呤酸,核酸的酶水解 核酸酶的分类 按底物专一性分:RNA酶(RNase),DNA酶(DNase) 按作用方式分:核酸内切酶,核酸外切酶 按作用键分:分水解3-磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶产物分别是5-磷酸核苷和3-磷酸核苷 常用的几种核酸内切酶 牛胰核糖核酸酶(RNaseI),水解嘧啶3-磷酸和其他核苷酸5-OH形成的酯键,产生3-末端为3-磷酸嘧啶核苷酸的核酸片段 核糖核酸酶T1,发现于米曲霉,水解3-鸟苷酸与其他核苷酸5-OH形成的酯键,产物为3-鸟苷酸为末端的寡核苷酸 牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI),水解DNA 3-磷酸酯键,产生5-磷酸
6、的寡核苷酸,平均长度为4个核苷酸 牛脾脱氧核糖核酸酶(DNase II),水解DNA 5-磷酸酯键,产生3-磷酸的寡核苷酸,平均长度为6个核苷酸,限制性内切酶 可识别特异的碱基序列并将其水解断开,产物带5-磷酸 基,已发现数千种,是基因工程的重要工具酶 回文序列 粘性末端与平头末端 限制性酶切图谱 常用核酸外切酶 蛇毒磷酸二酯酶:水解3-末端核苷酸与相邻核苷酸之间的3-磷脂键,产生5-磷酸NMP 牛脾磷酸二酯酶:水解5-末端核苷酸与相邻核苷酸之间的5-磷脂键,产生3-磷酸NMP N-糖苷酶 水解碱基与核糖之间的糖苷键 产物为含氮碱基和无碱基末端的寡核苷酸 核苷酸酶 水解核苷酸的磷脂键 产物为核
7、苷和磷酸,常用研究技术,核酸的分离纯化 一般原则: 条件温和,避免断裂 抑制核酸酶,避免降解 区分不同类型核酸 DNA的分离 主要在于除去Pr、RNA 在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下用蛋白酶消化细胞,再用苯酚和氯仿除去蛋白酶,用RNase除去RNA,操作在低温下进行,防止过酸、过碱、或机械振荡,可得高质量的DNA 真核生物染色体DNA与蛋白质的复合物(DNP)溶于水和浓盐溶液,但不溶于0.14mol/L的盐溶液,用苯酚或氯仿使蛋白质变性,DNA溶于水相 原核生物染色体DNA结合蛋白质较少,较易分离,用溶菌酶和SDS破碎细胞后,用氯仿异戊醇抽提Pr,再乙醇沉淀,重新溶解后用RNase除去RNA
8、,质粒DNA为cccDNA,分子量较小,有超螺旋,因此密度和染色体DNA有明显的不同,可以用超离心分开 RNA的分离纯化 RNA易被广泛存在的RNase水解,所有器皿与溶液都要经过处理除去RNase,在破碎细胞的同时应使RNase失活,在实验反应体系中要加RNase的抑制剂,常用皂土、二乙基焦碳酸、肝素、精胺。 目前常用的分离方法 胍盐氯化铯密度梯度离心(RNA密度1.89,DNA密度约1.71,蛋白质密度1.33) 酸性胍盐酚氯仿法,常用分离纯化技术 沉降分离 利用沉降速度和密度的不同分离核酸 RNA常用蔗糖密度梯度、DNA常用CsCl密度梯度 沉降次序:RNA闭环DNA线状DNA有开口的环
9、状DNA 碱基组成对密度有影响 加入啡啶溴红染料,作为指示剂 凝胶电泳 影响因素:胶浓度;核酸分子大小;核酸构象;碱基组成 电泳迁移率次序:超螺旋DNA线状DNA有开口的环状DNA RNA分离时,常加入蛋白质变性剂,如甲醛 加入碱基染料作为指示剂 电泳后核酸可用于分子杂交,也可回收使用 琼脂糖凝胶电泳:孔隙大,支撑强度不高,适用水平电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳:孔隙小,支撑强度高,适用垂直电泳,核酸序列的研究技术,核酸的碱基顺序分析 酶法分析 1975,Sanger提出加减法,1977,提出了末端终止法 利用ddNTP在相应的位置终止体外复制DNA链的延伸,从而获得不同长度的具有特定碱基末端的核苷
10、酸链,通过电泳分析,确定DNA的碱基序列 反应系统: 模板链,引物,DNA聚合酶 有同位素标记的4种核苷酸 分成四个反应组,分别加入对应ddNTP,比如T组加入ddTTP 当对应的ddNTP参入正在合成的核酸链时,合成在此处终止,形成不同长度的DNA片段 电泳将不同片段分开,读出DNA序列 DNA自动分析仪,分子杂交技术 定义: 利用变性后复性过程中,不同来源的核酸分子可以形成杂合双链的特点,用人工合成的探针标记特定序列的核酸分子 杂交技术 探针:人工合成的与目标核酸序列互补的小片段核酸序列,特异性的与目标核酸结合。带有标记物,可以用较简单的方法检测。 标记:放射性标记、酶标记、金属标记、抗原
11、抗体标记(地高辛) Southern杂交:探针与DNA杂交 Northern杂交:探针与RNA杂交 原位杂交:在细胞内进行的杂交,可以实现对核酸的定位,聚合酶链式反应技术(PCR) DNA体外扩增技术,利用DNA聚合酶在体外以目标核酸链为模板聚合复制DNA,达到扩增目标基因的目的 原理: 在有引物存在的前提下,DNA聚合酶以包含目的基因的DNA单链为模板,延伸引物链,形成DNA双链 DNA双链可以通过热变性拆分成单链,再与引物结合,作为模板继续复制DNA 通过上述过程的循环,可以实现目的基因的扩增 反应体系 DNA聚合酶:使用热稳定的DNA聚合酶,如Taq 目标基因链:合适的长度 引物:人工合成的与目标基因链互补的小片段DNA,可以根据需要,带上相应的标记物 含四种核苷酸的缓冲液,反应流程 热变性:常在95C下进行,时间一般2min5min 退火复性: 4550C,3040S 酶促聚合反应:7075 C,12min 重复上述步骤 PCR发展 自动PCR仪 RT-PCR 定量PCR,Sanger:寻找一种5-端正常,而3-端不能参与磷脂键形成的核苷酸。,N,S,W,标记的探针与不同分子结合,与RNA: Northern Blotting 与DNA: Southern Blotting 与蛋白质 Western Blotting,
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