1053蛋白质化学F.ppt
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1、第三章 蛋白质(Protein),蛋白质(protein)是由氨基酸为单位以酰胺键(肽键)连接起来的一类含氮的生物大分子。,蛋白质存在于所有的生物细胞中,是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大分子,构成生物体最基本的结构物质和功能物质。,蛋白质是生命活动的物质基础,它参与了几乎所有的生命活动过程。,元素组成:所有蛋白质都含有 C、H、O、N 四种元素,大多数蛋白质还含有少量的 S,有些蛋白质还含有一些其它元素,如 P、Fe、Cu、Mo、I等。,各种蛋白质的含氮量都很接近,都在16%左右,因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量,1克氮就相当于6.25克蛋白质。,10-5,主要内容
2、:,氨基酸的化学,肽,蛋白质的结构与功能,蛋白质的理化性质及其分离纯化,第一节 氨基酸化学,蛋白质用H+,OH-或酶彻底水解,可以得到许多种氨基酸的混合物,氨基酸是构成蛋白质的基本单位。,组成蛋白质的基本(标准)氨基酸(amino acid,Aa)有20种。,这些氨基酸中,大部分属于L-氨基酸。其中,脯氨酸属于L-亚氨基酸,而甘氨酸则属于-氨基酸。,一、蛋白质的基本单位L-氨基酸,1. L-氨基酸的结构通式及分子构型,或,结构通式(投影式),与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基,因而称为-氨基酸,构型:分子中各原子或基团之间的连接方式称为分子的构型。组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子,
3、在三维空间上就有两种不同的排列方式,它们互为镜影,这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。,L-氨基酸的分子构型(configurition),2. 基本氨基酸的分类、结构及代号,(1)按侧链R基的结构,氨基酸的分类,(2) 按侧链R基的极性,氨基酸的结构及代号:,(non-polar, hydrophobic),特殊氨基酸(Special amino acids) Gly,无光学活性(optically inactive),具环式结构的亚氨基酸(ring structure and imino acid),特殊氨基酸(Special amino acids) Pro,具有活性的巯基 (act
4、ive thiol)易氧化形成二硫键(disulfide bond), 可用作还原剂( reducing reagent),特殊氨基酸(Special amino acids) Cys,特殊氨基酸(Special amino acids) His,特殊氨基酸(Special amino acids) Phe, Tyr 和Trp,3. 蛋白质分子中不常见(非标准)的L-氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸,通常称为非标准(non-standard)氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本(标准)氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、3,5-二碘酪氨酸和
5、硒代半胱氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下:,二、天然的非蛋白质氨基酸,在细胞内已发现的非蛋白组成成分的氨基酸有300多种,尽管它们不是蛋白质的构成成分,但具有广泛的生物学功能。,如在尿素循环中的关键代谢中间产物:,1. 氨基酸的一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异,溶解性:各种氨基酸在水中的溶解度差别很大,并能溶解于稀酸或稀碱中,但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2) 熔点:氨基酸的熔点极高,一般在200以上。 (3) 味感:其味随不同氨基酸有所不同,有的无味、有的味甜、有的味苦,谷氨酸的单钠盐有鲜味,是味精的主要成分。 旋光性:除甘氨酸
6、外,氨基酸都具有旋光性,能使偏振光平面向左或向右旋转,左旋者通常用(-)表示,右旋者用(+)表示。 (5) 光吸收:构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收,但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,三. 氨基酸的主要理化性质,酪氨酸的max275nm,275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm,257=2.0x102; 色氨酸的max280nm,280=5.6x103;,2. 氨基酸的主要化学性质,(1) 氨基酸的离解性质及等电点,氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子,也能像碱一样接受质子,氨基酸
7、具有酸碱性质,是一类两性电解质。,As an acid(proton donor):,As a base(proton acceptor):,不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在:,正离子,两性离子,负离子,氨基酸所带静电荷为“零”时,溶液的pH值称为该氨基酸的等电点(isoelectric point),以pI表示。,实验证明在等电点时,氨基酸主要以两性离子形式存在,但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式,还有极少量的中性分子。,当溶液的pH=pI时,氨基酸主要从两性离子形式存在。,pHpI时,氨基酸主要以正离子形式存在。,pHpI时,氨基酸主要以负离子形式存在。,(a) 氨基酸的酸碱滴
8、定曲线,酸碱滴定曲线,等电点的计算,(b) 等电点的计算,中性氨基酸:以Gly为例,酸性氨基酸,以Asp为例:,Asp+,碱性氨基酸,以Lys为例:,Lys+,(2)氨基酸的化学反应,-氨基参加的反应,(a)成盐作用,(b)与HNO2的反应,(c)与甲醛的反应,(d)酰基化反应及常用的酰基化试剂,酰氯:,苄氧酰氯(Cbz-Cl):,对甲苯磺酰氯(Tos-Cl)or 5一二甲氨基萘-1-磺酰氯 (dansyl chloride, DNS):,叔丁氧酰氯(Boc-Cl):,酸酐:,邻苯二甲酸酐:,(R酰基),or,Cbz-Cl,Cbz-氨基酸,举例1:,氨基酸与苄氧酰氯(Cbz-Cl)的反应,氨基
9、酸与 5一二甲氨基萘-1-磺酰氯(dansyl chloride, DNS)的反应,举例2:,(e)烃基化反应,(f) 与2、4一二硝基氟苯的反应,2,4一二硝基氟苯,(R烃基),DNFB,DNP-氨基酸(黄色),(g) 与苯异硫氰酸(酯)的反应,PITC,-羧基参加的反应,(a)成盐和成酯反应,酰化氨基酸对-硝基苯酯,(活化酯),(式中Y酰基),(b)成酰氯反应,(c)成酰胺反应,体外:,体内:,(d)脱羧基反应,(e)叠氮反应,-氨基和-羧基共同参加的反应,(a) 茚三酮反应,(b)成肽键,侧链R基参加的主要反应,(a) -S-S-和-SH的氧化还原反应,R-SH:HS-CH2CH2OH
10、巯基乙醇(mercaptoethanol),HS-CH2COOH 巯基乙酸(mercaptoacetic acid),HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT),(b)苯环的黄色反应,(c)酚基的Millon反应(米伦氏反应),or,(d)pauly反应,(e)Folin一酚反应,+,磷钼酸,Tyr,磷钨酸,Trp,蓝色(钼蓝与钨蓝混合物),四 氨基酸分析分离,1分配层析法的一般原理:,主要根据被分析的样品(如aa混合物)在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的,,逆流分溶(逆流分配),2 纸层析,单向纸层析图,Rf值,双向纸层析图,
11、3 薄层层析,4 离子交换层析,原理:分离氨基酸时,用离子交换树脂作为支持物,利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应,由于各种离子交换能力不同,与树脂结合的牢固程度就不同,在洗脱过程中,各种离子以不同的速度移动,从而达到分离的目的。,这种分离主要与各种离子所带电荷有关,在电荷相同时,与极性,非极性有关。,5 高效液相层析(high performance (pressure) liguid chromatography, HPLC),HPLC的特点:,HPLC分离氨基酸的灵敏度高,可达到10-12mol水平,固相支持物颗粒小,比表面积大,溶剂系统采用高压,流速快,适于各种类型的
12、支持物的柱层析,(1)反相柱,(2)正向柱,HPLC常用的层析柱:,第二节 肽 (peptides),一、肽键 (peptide bond),2. 肽键的特点,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 肽键中的C-N键具有部分双键性质,不能自由旋转。 在大多数情况下,以反式结构存在。 在细胞内环境条件下,肽键相对稳定,二、肽(peptides),1. 几个相关的概念,肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。组成肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。,肽与氨基酸残基:,由两个氨基酸残基组成的肽称为二肽(dipeptide);由三个以上十个以下
13、氨基酸残基组成的肽称为寡肽(oligopeptide);由多个氨基酸组成的肽则称为多肽(polypeptide), 亦称多肽链。,二肽,寡肽与多肽:,通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基,称为氨基端或N-端;在另一端含有一个游离的-羧基,称为羧基端或C-端。,肽链的N-端与C-端:,氨基酸顺序:,在多肽链中,氨基酸残基按一定的顺序排列,这种排列顺序称为氨基酸顺序,氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始,以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。,上述五肽可简写表示为:Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,肽链的表示法(简写),多肽与蛋白质,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特
14、殊方式结合而成的生物大分子。,蛋白质与多肽并无严格的界线,通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。,蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。,2. 肽的理化性质,(1)两性解离与等电点,肽与氨基酸一样具有酸、碱性质,它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。,由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大,因此它们之间的静电引力较弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值,pK1。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值,pK2。R基的pK变化不大。,肽的等电点:肽所带净电荷为“零”时,溶液的pH值。,例:已知末端
15、-COOH,pK3.6,末端-NH3+pK8.0 -NH+3pK10.6。 计算Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。,pI=(8.010.6) /2 =9.3,(2) 肽的化学性质,肽的化学性质与氨基酸相似,如两性解离、等电点等,但肽有与氨基酸不同的特殊反应,(a)双缩脲反应,(b)肽键的紫外吸收 210230nm,3. 天然存在的某些活性肽,(1) 肌肽和鹅肌肽,肌肽(carnosine):-Ala-His,鹅肌肽(anserine):-Ala-1-Me-His,(2) 谷胱甘肽(glutathione,GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,As a r
16、eductant to protect nucleic acids and proteins from toxin by discharging free radical or H2O2,(3) 多肽抗菌素,(4) 多肽激素,种类较多,生理功能各异。 多肽类激素主要见于垂体及下丘脑分泌的激素,如催产素(9肽)、加压素(9肽)、促肾上腺皮质激素(39肽)、促甲状腺素释放激素(3肽)。 神经肽主要与神经信号转导作用相关,包括脑啡肽(5肽)、-内啡肽(31肽)、强啡肽(17肽)等。,垂体后叶激素如催产素和加压素,如由下丘脑分泌的激素之一 促甲状腺素释放激素,(5) 神经肽,甲硫氨酸脑啡肽 Tyr-G
17、ly-Gly-phe-Met,亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu,功能:镇痛,例如脑啡肽 (enkephalin):,Responsible for signal transduction (信号转导) in neurotransmission 脑啡肽(enkephalin);内啡肽(Endorphin);强啡肽(dynorphin); P物质 (Substance P);神经肽Y (neuropeptide Y),4 肽的人工合成,(1) 概况,20世纪初 E. Fischer:以氨基酸为原料合成了一个十八肽。,1932年 M.Bergman: Cbz,1953年 美国 D
18、u.Vigneaud:生物活性的催产素,1965年 中国:生物活性的牛胰岛素,1962年 美国Merrifield:固相合成法,(2) 合成方法,(a)液相合成法, 用缩合剂的方法,氨基保护基Y:Cbz、Boc、Tosyl,苄氧甲酰基(CGZ):,叔丁氧甲酰基(BOC):,对甲苯磺酰基(Tosyl):,甲酯(OMe): CH3O-,乙酯(OEt): C2H5O-,苄酯(OBzl):,叔丁酯(OBut):,羧基保护基Z:,缩合剂:N,N一二环己基碳二亚胺(N,N-dicyclohexyl carbodiimide,缩写DCCI或DCC),脱去氨基保护基的方法:,Boc用酸,如50%三氟醋酸脱去,
19、Tosyl用钠氨还原法,脱去羧基保护基的方法:,苄酯(OBzl)用催化加氢法,叔丁酯(OBut)用酸,如50%三氟醋酸脱去,Cbz用催化加氢法,甲酯或乙酯用皂化法, 将参与肽键合成的羧基和氨基活化,羧基的活化:,氨基的活化:,接肽时加入有机碱如三乙胺或KHCO3等,保证氨基处于自由状态,氨基即活化。,早期用酰氯,但反应太激烈,后来采用叠氮法,而现在用了最多的是活化酯法和混合酸酐法。,(b) 固相合成法,一、蛋白质的分类,(一)根据蛋白质分子的形状,1球状蛋白质(globular protein),2纤维状蛋白质(fibrous protein),第三节 蛋白质的结构与功能,(二)根据组成和溶解
20、度,1单纯蛋白质(simple protein): 也称简单蛋白质,完全由氨基酸组 成的蛋白质。,单纯蛋白质的分类(根据溶解度的不同),(1) 清蛋白(albumin):溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。如血清清蛋白。,(2) 球蛋白(globulin):不溶于水而溶于稀盐溶液,如血清球蛋白。,(3) 谷蛋白(glutelin):不溶于水、醇及中性盐溶液,但溶于稀酸、稀碱, 如米谷蛋白。,(4) 谷醇溶蛋白(prolamine):不溶于水,但溶于70%80%乙醇,如玉米 醇溶蛋白。,(5) 组蛋白(histone):溶于水及稀酸溶液,分子中含Arg、Lys 较多,呈 (弱)碱性,如小牛胸腺组蛋白。
21、,(6) 鱼精蛋白(protamine):溶于水及稀酸溶液,分子中含碱性氨基酸特 别多,呈(强)碱性,如鲑精蛋白。,(7) 硬蛋白(scleroprotein):不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液。如胶原 蛋白、角蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白等。,2结合蛋白质(conjugated protein):亦称复合蛋白质, 由蛋白质和非蛋白质两部分组成。,结合蛋白质的分类(根据非蛋白质即辅基的不同),(1) 糖蛋白(glycoprotein):含糖类,如胶原蛋白。,(2) 脂蛋白(lipoprotein):含脂类,如血浆脂蛋白。,(3) 核蛋白(nucleoprotein):含核酸,如核糖体。,(4) 磷蛋白
22、(phosphoprotein):含磷酸,如酪蛋白。,(5) 金属蛋白(metalloprotein):含金属,如铁蛋白含Fe。,(6) 血红素蛋白(hemoprotein):辅基为血红素,如血红蛋白。,(7) 黄素蛋白(flavoprotein):辅基为黄素(FAD或FMN), 如琥珀酸脱氢酶(含FAD)。,(三)根据功能,1. 非结构蛋白质,包括酶、激素蛋白、运输蛋白(转运蛋白)、贮存蛋白、运动蛋白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等。,2. 结构蛋白质,对生物体起支持和保护作用,主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。,为了对蛋白质结构叙述的方便
23、,人为地将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。,蛋白质的一级结构又称初级结构,二级结构、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结构或构象。,二、蛋白质的结构,随着蛋白质化学研究的进展,认为在二级结构和三级结构之间还可划分超二级结构和结构域两个层次,所以蛋白质的结构层次为:,一级结构,二级结构,超二级结构,结构域,三级结构,四级结构,(一)蛋白质的一级结构(primary structure),1定义:,蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的线性排列顺序(sequence)。,氨基酸顺序书写时,从 N-末端(N-terminus) 至 C-末端
24、 (C-terminus).,肽键(peptide bond)和二硫键(disulfide bond) 均属于蛋白质一级结构.,2蛋白质一级结构的测定,序列测定前的准备工作:,样品的纯度,相对分子质量,肽链的数目,氨基酸组成,一级结构的测定主要用小片段重叠法,原理:,Analysis of aa sequence in the polypeptide (protein sequencing),Sanger.1953, insulin Nobel prize Major step: purification, disulfide bond break(single chain) HCl degr
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