12分子生物学研究方法.ppt
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1、第十二章 分子生物学研究方法,2,SNP概述,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP):单个核苷酸的突变而引起的多态性。 单体型(Haplotype):染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单体型。相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体信息传递给后代。,3,SNP分类: 基因编码区SNP(cSNP): 同义cSNP:SNP导致的编码序列改变并不影响蛋白质的氨基酸序列,突变碱基和未突变碱基含义相同。 非同义cSNP:碱基改变使蛋白质序列发生变化,从而影响蛋白质的功能。常是生物性状发生改变的直接原因。 基因调控区SNP(pSNP):影响基
2、因表达量的多少。 基因间随机非编码区(rSNP): cSNP、pSNP在功能和疾病发生、发展方面具有更重要的意义。,4,SNP检测技术,基因芯片、Taqman技术、分子信标、焦磷酸测序。 Taqman技术原理: 探针设计上,利用荧光共振能量转换(FRET)技术,探针5和3端分别用特殊的染料标记,称为供体-受体染料对或引爆-猝灭染料对。 正常情况下,由于探针5端荧光基团和3端猝灭基团紧邻在一起,供体所发荧光由于其光谱在空间上接近受体染料而被猝灭,只有当两者分离时才能检测到供体所发出的荧光。,5,6,Taqman技术的基本原理是利用Taq酶的5核酸外切酶活性,PCR反应中除了两个传统的PCR引物P
3、1、P2外,还有第三个引物P3(等位特异性Taqman探针),含有待检测的SNP位点,特异结合在P1结合位点的下游。P3探针的5端和3端分别标有荧光基团和猝灭基团,因P3的3端被猝灭基团封阻而不能以自身为引物进行扩增。,7,PCR反应中,Taq酶以P1为引物合成新的DNA链,随着反应的进行,Taq酶接触到P3并激发其53外切酶活性,使P3从5端开始降解,最后DNA链得以延伸,而P3探针上的荧光基团和猝灭基团由于不再在一个分子上,荧光基团释放而发出荧光信号。,8,焦磷酸测序法: 核心:由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联反应。 四种酶:DNA聚合酶(DNA poly merase)、ATP硫酸化
4、酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)、双磷酸酶(apyrase)。 底物:5-磷酰硫酸(adenosine 5-phosphosulfate, APS)、荧光素(luciferin)。,9,每轮测序反应中,只加入一种dNTP,如果该dNTP与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi),PPi可最终转化为可见光信号,并由PyrogramTM转化为一个峰值,每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比,然后加入下一种dNTP,继续DNA链的合成。,10,第一步:1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合,然后加入酶混合物(DNA
5、Polymerase、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶)和底物混合物(5-磷酰硫酸APS和荧光素Luciferin)。,11,第二步:向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对,则会在DNA聚合酶的作用下,添加到测序引物的3末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。,12,第三步:在ATP硫酸化酶作用下,生成的PPi与APS结合形成ATP。在荧光素酶催化下,生成的ATP又与荧光素结合形成氧化荧光素,同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。,13,第四步:反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在双磷酸酶的
6、作用下发生降解。,14,第五步:加入另一种dNTP,使第24步反应重复进行,根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。,15,16,SNP应用,人类基因单体型图的绘制。 SNP与疾病易感基因的相关性分析。 指导用药与药物设计。,17,cDNA差示分析法克隆基因RDA,代表性差异分析(representational difference analysis, RDA): RDA充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板而以线性形式扩增单链模板的特性,通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法,特异扩增目的基因片段。,18,因试验对象(Tester)和供试探针(Driver)在接
7、受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理,形成平均长度256bp的代表群(representation),保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应中两者物质的量比要求达到1:100或更高,经2-3次重复,T群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的可能性。,19,20,使用Gateway技术进行克隆和表达一切皆有可能,21,通过TOPO反应将目的基因PCR产物连接到Entry载体中。,22,LR反应可将目的片段从Entry载体重组到表达载体中。Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点,目的载体中含有attR1和attR2位点,通过重组形成新的位点attB1和attB2,从而将目的基因亚克
8、隆到表达载体中。,23,双向电泳,等电聚焦:蛋白质在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷,因此可以在电场中移动,当蛋白质迁移至其等电点位置时,其净电荷数为零,在电场中不移动,据此将蛋白质分离。 SDS-聚丙烯酰胺:分子质量,24,25,26,27,28,29,30,31,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证
9、(western blot等),蛋白信息的初步获得,32,蛋白质的质谱分析技术,基质辅助激光解析电离:飞行质谱仪(MALDI-TOF)。 电喷雾质谱ESI-MS:,33,从2D胶中分离得到的或其它来源的蛋白质,酶解成小肽后与基质混合,将样品混合物点到金属靶表面上并使之干燥结晶,然后用激光轰击,将呈离子化气体的待分析物从靶表面喷射出去。 离子化的气体中每个分子带有一个或更多的正电荷,这些气体肽段在电场中被加速后,到达检测器的时间由肽段的质量和其所带电荷数的比值(m/z)决定。,34,35,生物质谱的一般流程: 蛋白酶解成肽段。 肽段分离。 离子进入质谱,得到质谱图。 用计算机软件将质谱图与蛋白数
10、据库进行比对,从而鉴定出蛋白。,36,37,38,基因表达系列分析技术,基因表达系列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)是以DNA序列测定为基础,定量分析全基因组表达模式的技术,能够直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。 Long SAGE;Short SAGE。,39,在转录组水平上,任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物。 因此,用特定限制性核酸内切酶分离转录产物中具有基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制成标签。 将这些序列标签连接、克隆、测序后,根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表
11、达频率。,40,41,42,原位杂交技术(in situ hybridization, ISH),是用标记的核酸探针,经放射自显影或非放射检测体系,在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位或相对定量研究的一种手段。 分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。,43,RNA原位杂交:用放射性或非放射性(地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应,若细胞中存在与探针互补的mRNA分子,两者杂交产生双链RNA,就可通过检测放射性标记或酶促免疫反应显色,对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。,44,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization
12、, FISH):首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记,然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合,再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 FISH技术不需要放射性同位素,实验周期短,检测灵敏度高。,45,按标记物不同又可分为直接标记法和间接标记法。 用生物素(biotin)或地高辛配体(digoxingenin)标记称为间接标记,杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号,因而步骤较多、操作麻烦,其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大,需进行染色体定位的基因片段往往较小,因而间接标记具有其优势。,46,直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标
13、记。由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号,省去了繁琐的免疫荧光反应,不再需要购买荧光抗体,也由于近年来荧光素的亮度和抗淬灭性的不断改进和提高,直接标记的荧光探针越来越成为首选,其荧光强度和信号大小都易于在普通荧光显微镜下观察,操作过程中也不需要严格避光,使FISH过程变得简便而易于操作。缺点是信号不能放大。,47,48,49,50,基因定点突变技术,重叠延伸介导的定点诱变: 大引物诱变法: 重叠延伸介导的定点诱变: 使用带突变碱基的互补引物对两段目的基因序列分别进行第一轮PCR扩增。 将扩增产物进行重叠退火延伸,获得带突变碱基的完整序列。 使用该完整序列的两端引物进行第二轮PCR扩增。
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