12杂交瘤技术与单克隆抗体.ppt
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1、,第12章 杂交瘤技术与单克隆抗体,新民周刊,2010,5.17-23.P76-9,2010.11.2:世界肺炎日(第2个) 全球每年约有160万人死于肺炎链球菌 疾病,平均每38秒1名5岁下儿童死于此 病,1100万儿童因肺炎住院。,中国是10个肺炎发病率最高的国家之一 ,1/4儿童携带病菌;死亡儿童该病占 46.8%。占西太平洋区的70%。,红霉素不敏感几乎达到100%,青霉素达 86%。,1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗 PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的 7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世 。目前已经接种3亿剂,世界第一大单 个疫苗。,2003年 SARS病毒,SA
2、RS病毒属于冠状病毒 科,病毒粒子多呈圆形, 有囊膜,外周有冠状排列 的纤突,病毒直径在80- 120nm之间。,感染病毒的细胞线粒体肿 胀,部分线粒体外膜或嵴 溶解,病毒颗粒主要分布 在胞浆的内质网池、胞浆 空泡内和细胞外,多聚集 成堆。,HIV病毒-艾滋病,HIV是艾滋病病毒(human,immunodeficiency virus)的缩写。 “人类免疫缺陷病毒”。逆转录病 毒,遗传信息存在于两个相同的RNA 单链模板中。艾滋病是1981年发现 的。,生存于人的血液中并攻击人体免疫 系统。把人体免疫系统中最重要的 T4淋巴细胞作为攻击目标,大量吞 噬、破坏T4淋巴细胞,从而使整个 人体免疫
3、系统遭到破坏,最终人体 丧失对各种疾病的抵抗能力而导致 死亡。,12-1 杂交瘤技术,将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够 分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞,经过 克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细 胞,这种技术通称为杂交瘤技术(hydridoma technique)。,历史发现,1975年,英国剑桥大学分子生物学研究室将已适 应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免 疫小鼠脾细胞(B淋巴细胞)进行融合,发现融 合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征:即像 骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增 殖,又能持续地分泌特异性抗体。,科勒(Kohler),米尔斯坦(Mil
4、stein),(一)免疫学基础,1 抗原:,进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用 的外源物质。,包括:蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各 种细胞等。,特点:结构表位性(抗原决定簇 ),12-2 单克隆抗体,免疫原特异性:(抗原与抗体的反应)抗原-刺激免疫系统-发生免疫应答-产生应答产物。,抗原的表位,抗原决定簇 : (antigen determinant);,又称为表位(epitope)。,存在于抗原分子表面的,能与淋巴细胞表,面特定受体或其分泌的抗体相结合的特殊化学 基团,称为抗原决定簇或表位。,18,T细胞与B细胞抗原决定簇的比较,2 抗体,互补性决定区(Complementarit
5、y determining region,CDR) VH 和VL的三个高变区共同组成Ig的 抗原结合部位。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面,决定 抗体的多样性与特异性。,动物免疫系统分泌的中和或消除 抗原物质的影响的物质,存在于 血清中,本质是免疫球蛋白 (Immuniglobulin,Ig)。, C:constant region V:variable region,抗体的来源,免疫系统:包括体液免疫和细胞免疫,参与的细 胞包括,B淋巴细胞发育成浆细胞,分泌抗体,参与 体液免疫,脾脏可以分泌。,T淋巴细胞发育成吞噬细胞,直接参与细胞 免疫,经胸腺分泌。不能产生抗体,帮助B淋巴 细胞产生抗
6、体。,(二)多克隆抗体与单克隆抗体概念,单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb):经过免疫的哺乳类动物单一的B淋巴细胞可以分泌单一性抗体,把这种具有特异性的、同质性的抗体称为单克隆抗体。 P126 动物脾脏有上百万个B淋巴细胞,它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体,一个B细胞就是一个克隆,故称为单克隆抗体。,一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族,因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体,因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物,称为多克隆抗体。,问题的引出,血液得到的只能是混合抗体,但是需要大量的仅 针对某一个抗原决定族的单克隆抗体,几乎是不 可能的
7、,因此必须采用其他方法。,3 单克隆抗体生产途径: 细胞融合:杂交瘤细胞 病毒转化:获得永久生长的B淋巴细胞,视频:,http:/ d_XMTY1ODg5MDI0.html,(三)杂交瘤制备单克隆抗体,单克隆抗体技术,分非特异性、特异性两类,1. 动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备,体外法:用抗原免疫离体的淋巴细胞,3-4d收获。 体内法:一般要经过初次免疫、第二次免役(向动物 腹腔内注射抗体)、加强免疫(向动物静脉内注射抗 体)3个过程。如果需要免疫脾细胞,一般取最后一 次加强免疫3天以后的脾脏,用无血清的培养液制备成B细胞悬液。,2.骨髓瘤细胞株的培养与筛选,骨髓瘤细胞系应和免疫B淋巴细胞源于
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