3zhou目的蛋白质表达、纯化、检测.ppt
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1、实验五 目的基因的原核表达及检测,现代分子生物学大实验,实验目的,重点掌握表达载体构建的原理及方法 掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法 了解目的蛋白质 “标签”纯化的基本原理和方法 掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法 掌握考马斯亮蓝染色的方法,实验原理,目的蛋白质的诱导表达 目的蛋白质的纯化 目的蛋白质的检测,实验原理,蛋白质的表达:将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。 体内很难分析单个蛋白质的作用 进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究 应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面,实验原理,图 pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16 peptides 融合蛋
2、白 在Hela细胞中的荧光显微镜检测(400),例,酵母表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统 表达的蛋白具有正常的活性、构象 技术难度较大、耗时、耗资,大肠杆菌表达系统 实验技术简单,时间较短,费用低,系统比较完备 不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工,易形成包涵体,原核细胞表达系统 真核细胞表达系统,实验原理,原核细胞表达系统菌株 菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。 堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。 大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7
3、表达系统而设计。,实验原理,原核表达质粒的构建 目的基因 表达载体,实验原理,目的基因 / DNA / PCR / 酶切 / Primer 例: p38中抑制多肽16肽序列 GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT ACA GAC CAT ATT GAT CAG TTG AAG CTC F 5-ACG GAT CC TA GGA AGA ACA TTG TTT CCT GGT-3 R 5-ACG GAT CC TTA GAG CTT CAA CTG ATC AAT ATG G-3 5端引物中AC是随机保护碱基,G GAT CC是BamH I酶切位点,TA是为防止移码而引入的两个碱
4、基,随后是编码16肽前7个氨基酸的碱基序列。 3端引物中AC是随机保护碱基,G GAT CC是BamH I酶切位点,TAA是终止密码子的反向互补序列,随后是从编码16肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。,实验原理,表达载体 能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件,就构成了表达载体。 元件 启动子、终止子、核糖体识别序列 诱导性表达所需要的元件 操纵子序列 调控基因 多克隆位点 融合Tag 复制起始序列 筛选标记/报告基因 各种表达载体的不同之处 在于其表达元件的差异。,实验原理,启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控
5、型表达。lac和Tac,PL和PR,T7是最常用的启动子, 转录终止子 核糖体结合位点,启动子、终止子、核糖体识别序列,操纵子序列及配套的调控基因,诱导性表达所需要的元件,多克隆位点 复制起始序列,实验原理,用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 (Tag)。 标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端,能够与目的基因融合表达(N端或者C端融合表达)。 目前常用的标签有 组氨酸标签(His-Tag) 谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferase)标签(GST-Tag) 硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)标签 麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding
6、 Protein, MBP) 蛋白质 A(protein A) 纤维素结合位点(cellulose binding domain)标签等。 一般对于小分子用较大的Tag(如GST)以获得稳定表达;而一般的基因多选择小Tag(如His)减少对目的蛋白的影响。,实验原理,筛选标记/报告基因表达 抗药性基因,Amp是最常见的筛选标记,kana,新霉素,四环素,红霉素和氯霉素。 抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰,比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。 GFP(绿色荧光蛋白)是最常用的报告基因了,半乳糖苷酶,荧光素酶。 一些融合表达Tag也有报告基因的功能。,实验原理,常
7、用表达载体 pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达系统的载体。 Ptac Promoter Amp pGEX - KG pET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。 T7 Kana pET - 14b,实验原理,目的蛋白质的诱导表达 lacI q(Lactose) lacI是大肠杆菌中lac 操纵子(Operon)的调节基因,它所表达的阻遏蛋白是lac 操纵基因(Operator)的抑制因子,抑制转录启动。 当有乳糖存在时,这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制,使lac 操纵子上的结构基因lacZ(-半乳糖苷酶)、lacY(透性酶)、lacA(乙酰基转移酶
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