3细胞生物学的研究方法.ppt
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1、医学细胞生物学(配套教材),第三章 细胞生物学研究方法,Technology for Cell Biology,学习目的与要求,掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用。 熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点。 了解细胞生物学研究方法的进展。,第三章 细胞生物学研究方法,Technology for Cell Biology,第一节 显微镜技术,一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、纳米显微技术 四、超分辨光学显微技术,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率 1.分辨率(resolution,R) 显微镜或人眼在25
2、cm的明视距离处,能分辨 被检物体微细结构最小间隔的能力。,一、光学显微镜技术,Cell,2010(143):1047-1058,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,不同显微结构的尺寸,由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。,Cell,2010(143):1047-1058,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,2.分辨率公式,n = 聚光镜和物镜之间介质的折射 率,空气为1,油为1.
3、5。 = 标本对物镜镜口张角的半角, sin的最大值为1。 = 照明光源的波长,白光0.5 m 。,横向分辨率 Rx,y=0.61/nsin,纵向分辨率 Rz=2/(nsin)2,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,3.组织切片制备过程 固定(fixation) 使大分子交联而保持在原有的位置上,防止结构移位或信息丢失。 常用的固定剂:戊二醛、甲醛 包埋(embedding) 使组织形 成硬块,便于切片。 常用的包埋剂:石蜡、树脂,Technology for Cell Biology,第三章 细
4、胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,3.组织切片制备过程 切片(section) 切片厚度为110m。 染色(staining) 增大反差。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)普通光学显微镜的分辨率,一、光学显微镜技术,组织切片制备过程,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,宫颈鳞癌组织切片,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像 1.荧光和荧光染料 荧光 荧光分子可以在吸收特
5、定波长的光后,发射出更长波长的可见光,称为荧光。前者称为激发光 (excitation light),后者称为发射光(emission light)。 荧光染料 由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色,因此也称荧光染料。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,常见荧光分子的激发光与发射光波长范围,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,荧光素(fluorescein),绿色荧光,四甲基罗丹明(tetramethyrhodanmine), 红色荧光,Technology for Cel
6、l Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像,2.荧光显微镜工作原理 荧光显微镜(fluorescence microscope)的结构特点: 以高压汞灯和弧光作为光源。 两组滤光片。,荧光显微镜的光学系统,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像,3.应用 成像反差强,检测灵敏度高。 定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质。 对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究
7、方法,一、光学显微镜技术,(三)相差显微镜通常被用于观察活细胞,原理:,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,相差显微镜(phase contrast microscope):利用光的衍射和干涉效应把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差,使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。,(三)相差显微镜通常被用于观察活细胞,应用:活细胞观察,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,相差显微镜观察培养中的HeLa细胞,Technology for Cell Biol
8、ogy,第三章 细胞生物学研究方法,相差显微镜下观察到的悬浮生长的昆虫草地夜蛾卵巢Sf9细胞,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,原理:散射光成像。 应用:分辨率不高。 适合观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。,(四)暗视野显微镜通过散射光成像,暗视野显微镜工作原理,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(五)显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程 原理:用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔拍摄。 应用:准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。,Techn
9、ology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(六)共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色 三维图像,原理: 单色激光作为光源。 共聚焦:物镜和聚光镜互相共焦点,只有从标本焦面发出的光线聚焦成像,焦面以外的漫射光不参加成像。 逐点扫描。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜技术,(六)共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色 三维图像,应用:进行连续的光学切片,通过电脑进行 三维重建。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、光学显微镜
10、技术,共聚焦激光显微镜工作原理示意图,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,共聚焦激光显微镜下的血管内皮细胞微丝的分布,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三维图像,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,以电子束作光源,波长短,分辨率高。 电子显微镜分辨率 理论值:0.002nm 实际值:0.1nm 生物样品:2nm 电镜下观察到的结构称为超微结构。,二、电子显微镜技术,Technology for Cel
11、l Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(一)透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM ),光学显微镜与透射电子显微镜的比较,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,透射电子显微镜标本制备过程: 固定:双重固定锇酸固定脂类,戊二醛固定蛋白。 脱水:含水标本干扰观察。 包埋:环氧树脂是常用包埋剂。,(一)透射电子显微镜,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,透射电子显微镜标本制备过程 切片:电子的穿透力有限,需制
12、作超薄切片,厚度通常为50100nm。 染色:生物分子散射电子能力弱,需通过重金属染色,增大反差,常用锇、铀、铅等重金属的盐类。,(一)透射电子显微镜,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,(二)扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM),原理:通过电子束照射在标本后产生的二次电子成像,二次电 子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关。 应用:可以直接观察标本表面的三维形态。,科学Scientific American 中文版,Technology for Cell Biology,第
13、三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,(二)扫描电子显微镜,科学Scientific American 中文版,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,扫描电镜的工作原理,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,扫描电镜观察的有丝分裂中期染色体形态 (中国医科大学宋今丹提供),Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,凋亡细胞及凋亡小体透射电镜照片(左)和扫描电镜照片(右),显示凋亡细胞的细胞核固缩,凋亡小体正从细胞脱落。 (中国医科大学
14、宋今丹提供),Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(三)透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像,1.金属投影法(metal shadowing) 原理:以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属,显示 投影效果,给出样品表面三维结构。 应用:观察蛋白、核酸类大分子,病毒颗粒及细胞壁,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,2.冰冻断裂(freeze-fracture),样品制备:,应用:观察细胞膜性结构的内部构造。,Technology for Cell Biolo
15、gy,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,2.冰冻断裂(freeze-fracture),Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,叶绿体内膜冰冻断裂复形,显示内膜上存在大量膜蛋白,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,3.冰冻蚀刻(freeze-etch),应用:观察细胞的内部构造。,样品制备:,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,3.冰冻蚀刻(freeze-etch),Technology for Cel
16、l Biology,第三章 细胞生物学研究方法,二、电子显微镜技术,冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白纤维,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,纳米尺度:1nm100nm 生命是纳米尺度的分子活动,细胞是纳米组装机的集合体。 扫描隧道显微镜和原子力显微镜的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平,被称作纳米显微技术。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,1.扫描隧道显微镜(scanning t
17、unneling microscope,STM),原理:使用原子尺度的探针在标本的表面进行扫描,在探针 针尖和样品间施加一定电压,产生随标本表面形貌变 化的隧道电流。 特点:分辨率高,可在大气和液体等非真空状态下工作。 应用:直接观察大分子的三维结构,如DNA双螺旋结构 。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,1.扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM),扫描隧道显微镜下的人红细胞血影,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术
18、,2.原子力显微镜(atomic force microscope,AFM) 原理:通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所 观察表面的微观信息。 特点:可以在三态(固态、气态和液态) 状况下工作。 应用:活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面观测 进行单个分子操作。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,2.原子力显微镜(atomic force microscope,AFM),针尖的曲率半径通常为5-10nm,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,三、纳米显微技术,原
19、子力显微镜下的中国仓鼠卵巢细胞 原子力显微镜下的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,原子力显微镜观察细胞膜表面,显示两种分子大小不同的膜脂参与了此细胞膜的组成。 原子力显微镜测定大分子间的作用力。左图中DNA分子固定在支持物上,原子力显微镜的探针吸附了与DNA分子结合的蛋白。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,四、超分辨光学显微技术,由光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限称 为Abbe限度(Abbe limit)。 应用新的光学原理、发光/示踪分子和信号分析 技术
20、,建立起了能够突破Abbe限度的超分辨显 微技术,使光学显微镜的分辨率达到了3050nm 的纳米尺度。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,四、超分辨光学显微技术,光的衍射效应使物镜的焦点呈椭圆形(左);当两点间的距离大于衍射限度时,物镜能够呈现两个像,如两根微管的横切面A;当两点间的距离小于衍射限度时,物镜不能够呈现两个像,如两根微管的横切面B。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,STED显微技术成像与共焦显微技术成像比较 以线粒体膜蛋白TOM20为标志蛋白,左上为共焦显微镜呈现的线粒体结构,右
21、上为STED显微镜呈现的线粒体结构。左下为TOM2和线粒体基质蛋白HSP70在共焦显微镜下呈现的线粒体结构。右下为由STED技术重建的线粒体三维结构。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,SIM显微技术成像与共焦显微技术成像比较 将核孔复合体标记成红色,核纤层蛋白B标记成绿色、DNA标记成蓝紫色,用共焦显微镜呈现的细胞核中间位置横切面结构,小图为方框内的细微结构(上);相同方法标记细胞核,SIM技术三维重建后呈现的细胞核中间位置横切面结构。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,第二节 细胞的分离和培
22、养,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,从组织中分离细胞的第一步是将组织制备成游离的细胞悬液。,一、不同类型细胞的分离,细胞分离需根据不同细胞的特征采用不同的方法。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(一)离心方法 利用细胞的密度特性可有效分离不同的细胞。如血浆白细胞和红细胞的分离。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,流式细胞仪(flow cytometer):从多细胞悬 液中分离目的细胞的精密仪器。 样品处理:用带有荧光的
23、特异抗体标记待分离 的细胞。 分离速度:2万个细胞/s 。 分离纯度:95% 。,(二)流式细胞术,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(二)流式细胞术,Beckman FC500 流式细胞仪外形,流式细胞仪工作原理,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,Beckman FC500 流式细胞仪分析结果,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,(三)免疫磁珠法,利用带有特定单抗的免疫磁珠(immunomagnet
24、ic microsphere)与靶细胞的特异结合,快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(三)免疫磁珠法,分离纯度:9599,Technology for Cell Biology,第三章 细胞生物学研究方法,一、不同类型细胞的分离,(四)激光俘获显微切割技术(Laser Capture Microdissection,LCM) 原理:在载玻片上制作冰冻或石蜡切片并染色,通过直接的 显微镜观察,用能量较低的红外激光切割而获得所需要的组织细胞,甚至单个细胞。 应用:从组织切片中精确地分
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