3酶与辅酶.ppt
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1、1,第四章 酶和辅酶,第一节 概述,第二节 酶的化学结构与催化活性,第三节 酶的作用机理,第四节 影响酶促反应的因素,第五节 酶工程简介(自学),第六节 维生素和辅酶,本章重点和难点、复习思考题,2,一 酶的概念,二 酶的作用特点,1与一般催化剂的共性,2作为生物催化剂的特点,三 酶的分类与命名,1习惯命名,2. 系统命名,第一节 概述,3. 其它习惯归类命名法,四 酶分离提纯与活力测定,1. 分离提纯(自学),2. 酶活力测定,3,一 酶的概念 1926年, Summer: 脲酶结晶酶是活细胞产生的具有特殊催化能力的蛋白质,是生物催化剂。 2 拟酶(核酶): 1981年,Cech(USA)发
2、现四膜虫的rRNA前体有催化活性,自我剪切和拼接形成有生物功能的26S rRNA。 3 脱氧核酶:具催化活性的DNA。,4,5,4 抗体酶(abzyme,催化抗体 ): 一类具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体 。 1980s.Lerner发现某些抗原与抗体结合时才转位到抗原分子的表面, 这种现象类似于酶与底物诱导契合。 Tramontano 等用一种在结构上与某些酯类水解反应的过渡态相似的化合物用为半抗原制备单克隆抗体。此抗体能使酯的水解反应加速1000倍。,6,一般认为: 酶是生物体内活细胞产生的、能催化热力学上允许进行的化学反应的催化剂 化学本质:绝大多数为蛋白质,少数为核酸。 生
3、物细胞都产生自己所需的酶。 生物体中各种代谢反应都需特殊的酶参加。,7,二 酶作用的特点 1 与一般催化剂的共性, 在反应前后本身不发生质和数量上的变化。 能加速反应达到平衡点,但不改变平衡 只能催化热力学上允许发生的化学反应, 不能催化本身不能发生的化学反应。 都能降低反应所需要的活化能。 用量少而效率高。,8,2 作为生物催化剂的特点, 酶是蛋白质组成,具有蛋白质的一切属性。 能使蛋白质变性的因素如高温、强酸、强碱、重金属离子、紫外光等因素都会使酶丧失活性,而无机催化剂在高温等条件下也不失效。,9, 酶的催化效率高 酶催化反应的反应速度比催化反应的速度要高108-1020倍 易变性 使蛋白
4、质变性的理化因素(强酸、 强碱、重金属、高温、紫外线、超声波、剧烈振荡等)均可影响其活性。 酶活性的可调节性 有些酶的催化活性与辅因子有关。除去辅因子后酶失去活性。,10, 作用底物的专一性/特异性: 酶对其作用的物质(底物、substrate)有严格的选择性。 酶的专一性实质上是酶分子对底物分子的识别。 不同的酶所表现的专一性在程度上有很大的差别,主要取决于酶的活性中心的构象和性质。,11,酶专一性,结构专一性,立体异构专一性,相对专一性,绝对专一性,键专一性,基团专一性,旋光异构专一性,几何异构专一性,12, 结构专一性:对底物分子化学结构的特殊要求 绝对专一性: 只作用于一种底物(脲酶只
5、作用于尿素) 相对专一性: 作用于一类化合物或一种化学键. * 键专一性:如酯酶, -COOR * 族专一性(基团专一性): 胰蛋白酶只水解Lys、 Arg的-COOH参与的肽键。,13, 立体异构专一性: 对底物化学结构的立体构型有要求和选择. 旋光异构专一性: L-氨基酸氧化酶只能氧化L-氨基酸。 几何异构专一性:延胡索酸酶只作用于延胡索酸(反-丁烯二酸), 而不能作用于顺-丁烯二酸。,酶作用的专一性机理,14,三 酶的分类与命名 1 习惯命名 根据作用的底物命名,如淀粉酶分解淀粉、酯酶分解酯等。 根据催化的反应性质命名,如催化脱氢的酶叫脱氢酶,催化转氨基作用的酶叫转氨酶。 根据底物及催化
6、的反应性质命名.如琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢氧化。,15, 根据酶的来源命名。 来源于胃的蛋白酶叫胃蛋白酶,来源于胰脏的叫胰蛋白酶。 惯用命名法比较好命名,但缺乏系统性;酶常常重复,一酶多名或一名多酶。,16,2 系统命名 Enzyme Commission(酶学委员会,EC): 酶的名称应明确表明:酶的底物及催化反应的性质。 包括:底物及反应类型, 若有多种底物都应表明, 用“:”分开。若底物是水时可以略去。名称最后加一个“酶 ase” 字 如: 乙醇脱氢酶系统命名为: 乙醇:NAD+ 脱氢酶,17, 6大类: 1、2、3、4、5、6 根据底物中被作用的基团或键的特点,每一大类又可分为若干亚
7、类, 1、2、3、 每一亚类可分为若干亚亚类, 酶在亚亚类中的排号 酶的分类编号由4个数字组成, 每个数字间用“.”分隔, 编号之前都要用EC. 如: EC4.2.1.2, 分类与编号:,18, 酶的6大类:, 第一大类:氧化还原酶类, 第二大类:转移酶类, 第三大类:水解酶类, 第四大类:裂合酶类, 第五大类:异构酶类, 第六大类:合成酶类,19, 第一类: 氧化还原酶类(Oxido-reductases) 包括: 脱氢酶,氧化酶,过氧化物酶,加氧酶, 羟化酶等。,乙醇脱氢酶:催化乙醇脱氢 乙醇:NAD+ 氧化还原酶(EC1.1.1.1),20, 第二大类: 转移酶类(transferase
8、) 催化分子间基团的转移,通式:AX+B=A+BX,如 氨基转移酶、甲基转移酶、磷酸转移酶等。,如:谷丙转氨酶(Glutamate-Pyruvate transaminase, GPT):催化氨基从Ala转到a-酮戊二酸的酶。,21, 第三大类:水解酶类 利用水分子使底物分子共价键断裂, 即催化水解的酶类. 通式:R-R+ H2O RH + ROH 如淀粉酶, 蛋白酶类等,22, 第四大类: 裂合酶类(lyases) 能催化一种化合物分裂为几种化合物,或由几种化合物合成一种化合物。,裂解反应大多是从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应。 通式为:A-B=A+B,包括: 醛缩酶、水化酶、
9、脱羧酶及脱氨酶等。,23, 第五大类: 异构酶类(isomerase) 催化各种同分异构体(即分子式相同,而结构式不同的化合物)间的相互转变, 即促进分子内部基团的重新排列, A = B,包括几种不同类型: 异构酶:如葡萄糖-6-磷酸异构酶,G6P到F6P。 易向酶:催化不对称碳原子上的基团易向. 变位酶:催化分子内基团的易位. 消旋酶:D-氨基酸消旋酶使D-aa变为 L-aa 分子内氧化还原酶 分子内转移酶,24,25, 第六大类:合成酶类(synthetase)或连接酶(ligases)。 催化两种物质(双分子)合成一种物质的反应,这种合成反应一般是吸能过程。因而通常有ATP等高能物质参加
10、反应。 通式可写成为: A + B + ATP = A-B + ADP + Pi (AMP+PPi),谷氨酰胺合成酶(GS,glutamine synthetase) 催化谷氨酰胺的合成。 NH3 + Glu + ATP Gln + ADP + Pi + H+,26,3 其它习惯归类命名法 按酶蛋白(催化反应时的组合方式)分 单体酶(monomeric enzyme): 只有一条肽链组成,大多数属于水解酶类,如蛋白酶、胰蛋白酶、核糖核酸酶、 溶菌酶等。 寡聚酶(oligomeric): 由相同或不相同的两条以上亚基构成的,不是以共价键连接,彼此之间很易分开。 多酶复合体(multienzyme
11、 complex): 是由几种酶彼此嵌合形成的复合体,能催化一系列反应连续进行。例如脂肪酸合成酶、丙酮酸脱氢酶系.,27, 按酶含量稳定性分 恒态酶: 参与代谢和物质转化的基本组成的酶, 含量一般相对恒定, 其活性仅受基本反应动力学系统本身和组成因素的调节 调节酶: 在代谢和物质转化起调节作用的酶, 含量和组成因机体的机能状况而不同. 如共价调节酶(酶原激活、磷酸化与脱磷酸化等)、 别构酶、 同工酶、多功能酶。,28, 按合成特点分: 组成酶(结构酶): 诱导酶:在诱导时合成的酶 按作用位点分: 胞内酶:包括结合酶和溶酶 胞外酶:,29, 酶的组成分类 简单蛋白酶(单成分酶): 只由蛋白质成分
12、,由蛋白质起催化功能 结合蛋白酶(双成分酶): 除蛋白质部分外,还含有非蛋白组分的这种酶,也叫全酶(holoenzyme)。 全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子.,30,四 酶的分离提纯及活力测定 1 分离提纯(自学) 目的: 研究酶的理化性质(结构、功能、生物学功能等);酶的鉴定;作为生化试剂或药物。 步骤: 材料的选择与预处理,31, 细胞破碎 抽提:低温, 缓冲溶液, 分离与提纯: 方法有盐析、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀、离子交换法等 注意: 操作应在低温条件下; 加入EDTA螯合剂以防止重金属使酶失活; 加入少量巯基乙醇以防止酶蛋白-SH被氧化;不能过度搅拌以免产生大量泡沫使酶失活; 等等
13、,32, 保存:将酶制品进一步浓缩,结晶,干燥,以便保存. 一般应在-20以下低温保存。 保存浓缩的酶液,用硫酸铵沉淀或硫酸铵反透析法使其浓缩. 冰冻干燥: 先低温结冰再减压使水分升华. 浓缩酶液加入等体积甘油后可于-20以下较长时间保存.,33,2 酶活力测定 酶活力(酶活性, enzyme activity): 酶催化一定化学反应的能力, 通常以最适条件下它所催化的化学反应的速度来表示. 酶催化的反应速度愈大, 酶的活力愈大。反之亦然。 酶促反应速度: 习惯上是根据某酶在最适条件下,单位时间内催化底物减少的量或者产物的生成量来表示。,34, 反应速度测定原理: 终点法 即反应进行一段时间后
14、中止反应,再用理化方法来测定底物或产量的变化量。 动力学法 即连续测定反应过程中产物、或反应物、或辅酶的变化量,直接测定酶反应的初速度.,35,斜率=浓度/时间, 酶活力的主要测定方法 分光光度计法 荧光法 同位素测定法 电化学方法:pH测定法、(氧)电极法 旋光法 气体检测法,36, 酶活力的表示方法 活力单位(active unit):在最适条件下,单位时间内酶促消耗底物的量或生成产物的量。 1活力单位 (国际单位,U):酶在最适条件(最适pH,最适底物浓度, 25) 1分钟催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量: 1 Kat: 每秒钟转化1 mol底物所需的酶量。 1 Kat= 6107
15、U,37,酶的比活力(specific activity): 每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数, 一般用“酶单位数/mg蛋白”来表示. 表示酶的纯度,比活力愈高,表示酶愈纯。 酶转换数(turnover number) Kcat: 酶被底物饱和时,每秒钟、每个酶分子转换底物的微摩尔数,也称酶的分子活性(molecular activity). Kcat= K3, 即酶将底物转换成产物的效率。,38,第二节 酶的化学结构与催化活性,一、酶的化学组成与类别,1单纯蛋白酶类,2结合蛋白酶类,二、酶的结构与功能,1活性中心与必需基团,1酶的变构效应,2同工酶,3酶原的激活,6固定化酶(自学),三、酶结
16、构与酶活性调节,4酶的化学修饰调节,5酶分子的聚合和解聚,39,一 酶的化学组成及类别 1 单纯蛋白质酶类(simple protein): 只含氨基酸,酶活性仅仅决定于它的蛋白质结构, 如酯酶, 脲酶等。 2 结合蛋白质酶类(conjugated protein): 全酶 = 酶蛋白(apoenzyme, 脱辅酶)+ 辅助因子(cofactor),40, 辅助因子 辅酶(coenzyme): 与酶蛋白结合较松驰,用透析法可能与酶蛋白分离的辅助因子。 辅基(prosthetic group): 与酶蛋白结合较紧密,用透析法不能除去的小分子物质称为辅基。, 辅助因子类型 金属离子:Zn2+、 F
17、e2+、K+、Cu2+、Na+、 Mn2+ 金属有机化合物, 如CytC的为铁卟啉 小分子有机化合物, 如NAD, FAD等,41, 酶蛋白: 单体酶:只有一条多肽键,分子量在13000- 35000之间,一般是水解酶 寡聚酶:由2个以上的亚基组成,亚基之间由非共价键相连,亚基可以是相同的,也可以是不同的,分子量在35000-几百万. 多酶复合体:由几个酶有组织的聚集在一起形成有一定结构的复合体。,功能上相互配合,一个酶的产物是第二个酶的底物,如丙酮酸脱氢酶系、脂肪酸合成酶系。有利于一系列反应的连续进行,有利于提高酶的效率,便于机体对连续反应的调控。,42,43,二 酶的结构与功能 1 酶的活
18、性中心与必需基团 必需基团: 在反应过程中酶与底物的接触只限于酶分子的少数基团或较小部位,其中有些基团若经过化学修饰(如氧化、还原、酰基化、烷基化等)使其改变,则酶的活性丧失。 酶的活性中心: 酶分子中直接和底物结合,并和酶催化作用直接有关的区域。,44, 单纯蛋白质酶类: 活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基上的某些基团。 它们在一级结构上可能相距甚远,甚至位于不同的肽链上,通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近。 对于需要辅因子的酶: 辅酶或辅基(或它们分子上的某一部分结构)往往就是活性中心的组成部分。,45,46, 活性中心的两个功能部位: 结合部位
19、: 底物与酶分子结合的部位,由一些参与底物结合的有一定特性的基团组成,决定酶的专一性。 可有各种亚位点,分别与底物不同部位结合。 催化部位: 底物的敏感键在此处被打断或形成新的键, 从而发生一定的化学变化,由参与催化反应的基团组成,决定酶的催化能力。 一个酶的催化位点可以有多个。,47, 活性中心特性: 多为一凹穴,穴内基团多数是非极性,仅含有少数几个极性基团,形成一个疏水的微环境。凹穴的非极性环境对酶促反应的进行非常有利。 活性中心的常见基团: SerThr的-OH, His的咪唑基、Cys的巯基、 AspGlu侧链羧基。 活性中心的基团均属必需基团,但必需基团还包括活性中心外对维持酶空间构
20、象的必需基团。 只有酶活性中心的功能基团处于适当的空间位置,酶才具有活性.,48,49,The active site pocket lies just below and to right of Ser195,S,S,S,S,Active site: Ser195, His57,Asp102,Chymotrypsin (胰凝乳蛋白酶),50,Chymotrypsin (胰凝乳蛋白酶),Trypsin (胰蛋白酶),51,Carboxypeptidase A (羧肽酶 A),52,溶菌酶的活性中心,为一种黏多糖溶解酶,能液化细菌细胞壁,革兰阳性菌细胞壁构成的不稳定性多糖类物质,使肽链断裂成可溶
21、解的小分子可溶性粘肽,从而杀死细菌。,53,三 酶结构与酶活性调节 1 酶的变构效应 别构(变构)酶: 具有多个亚基,分子表面除具有活性中心外, 还有调节位点的酶. 一个或多个调节位点, 调节位点间,调节位点与活性位点间在空间上通常是分开的。 一般为分支代谢的第一个酶。 寡聚酶。含有二个或二个以上亚基。,54, 别构效应: 调节物与调节位点结合使别构酶构象改变,使酶活性中心对底物的结合和催化作用受到影响,从而调节酶的反应速度和代谢速度。,55, 别构酶的动力学不遵循米氏方程,而呈S形曲线。,56, 别构效应物: 引起别构效应的调节物 正效应物, 负效应物(使酶性下降) 大多数为寡聚酶: 催化亚
22、基(具活性中心), 调节亚基. 同促效应: 调节物就是底物 异促效应: 调节物不是底物, 两者结合在 不同的部位上。 同促-异促效应: 受底物分子和调节物分子 的调节.,57, 别构酶活性调节的机理(自学) 序变模型: 多个亚基依次分别与底物(调 节物)结合,构象依次发生改变. 紧张型(T型) 松驰型(R型) 齐变模型:别构酶或者全部呈T态(不利于 结合底物), 或者全部是R态(利于结合底 物), 每个亚基都同步发生这种改变 紧张型(T型)松驰型(R型),58,59,60,天冬氨酸转氨甲酰酶 (ATCase): 六个催化亚基形成二个三聚体, 六个调节亚基形成三个二聚体。 有六个催化位点和六个调
23、节位点。 CO2+Gln+ 2ATP氨甲酰磷酸 + 2ADP + Pi + Glu(合成酶) 氨甲酰磷酸 +Asp Pi + 氨甲酰天冬氨酸 (ATCase) - - - - CTP(反应终产物) CTP是ATCase的别构抑制剂,ATP是它的别构激活剂。, 例子(自学),61,62,Six catalytic subunits (C), Six regulatory subunits (R),T,R,63,64, 当底物只有氨甲酰磷酸和Asp,天冬氨酸转氨甲酰酶 (ATCase)的反应动力学曲线为S型。 表明底物开始时与酶结合力不高,一旦结合后引起酶分子构象发生变化而使酶分子上其它的Asp结
24、合部位对Asp的亲和力增强,从而加快反应。即发生正协同效应。 当反应体系中有CTP时,CTP与ATCase的调节亚基结合酶分子后变成对底物亲和力低的构象,从而使酶与后续Asp的亲和力减弱,反应速率下降,S型曲线右移。,65, 当体系加入ATP时,ATP与酶的调节亚基结合后使酶构象变成与底物亲和力高的形式,从而与Asp的亲和力增强,反应加快,S型曲线左移。 当ATP的浓度使酶饱合时曲线呈双曲线,别构效应消失。,66,ATP使酶饱合,+ ATP,无ATP或CTP 只有底物,+ CTP,CO2 + Gln + 2ATP氨甲酰磷酸 + 2ADP + Pi + Glu(合成酶) 氨甲酰磷酸 +Asp P
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