5碱性磷酸酶米氏常数的测定.ppt
《5碱性磷酸酶米氏常数的测定.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《5碱性磷酸酶米氏常数的测定.ppt(21页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、实验八 碱性磷酸酶米氏常数的测定,石 巍,一、目的要求,1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定的原理和方法,测出碱性磷酸酶在以对硝基酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法 (一)利用吸收光谱对物质进行定性分析 1原理,(二)利用吸收光谱对物质进行定量分析 1原理 Beer-Lambert(比尔)定律: T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中:T为透光率;A为吸光率;I0为入射光强度;I为透射光强度; K为吸收系数;C为溶液浓度;L为溶液光程的厚度,2常用方法 (1)标准曲线法 OD
2、或 浓度 标准曲线与样品的测定条件必须一致。,(2)标准管法 CX/AX=CS/AS,已知CS,测定AS、AX,可求得CX。 (3)摩尔吸光系数法 C=A/(为L=1cm,C为1mol/L时的吸光系数,也称为摩尔吸光系数。,(二)米氏常数的测定原理,酶促反应v-S曲线 v S 推导出米氏方程为: 其中S为底物浓度;v为初速度;Vm为最大反应速度;Km 为米氏常数,米氏常数Km是酶的一个基本特征常数,它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时,米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。 测定Km和Vm,可通过作图法求得。 最常用的Lineweaver-B
3、urk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式,即: 以1/v对1/S作图,可得一条直线,1/v 1/Vm -1/Km 1/S 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm. 反应式:pNPP+H2O pNP+HPO42- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物pNP的含量,求出反应速度v。,二、分光光度计的使用,仪器操作键介绍 “方式设定”键(MODE):用于设置测试方式 透射比(T)、吸光度(A)、已知样品浓度值(C)、已知标准样品斜率(F) “100%”键:用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%”键:用于自动调整零透射比
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 碱性磷酸酶 常数 测定
链接地址:https://www.31doc.com/p-3018283.html