7第七章抗体工程制药.ppt
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1、第七章 抗体工程制药,一.概述,抗体(工程)制药生物技术制药领域的重要组成部分,抗 原(antigen,Ag) -是指那些能够刺激和/或诱导机体免疫系统发生免疫应答、产生抗体和/或致敏(效应)淋巴细胞,同时又能与免疫应答产物在体内外特异性结合,发生免疫反应的物质。 如:病原微生物、免疫血清、药物、疫苗 对机体来说,抗原相当于一个国家已知的或潜在的、外部的或内部的“敌人”。,4,免疫原性:指能刺激机体产生抗体和/或致 敏淋巴细胞的性能。 反应原性:能与相应的抗体和/或淋巴细胞 发生特异性结合,发生反应的性能。,5,完全抗原:既具有免疫原性,又具有反应原性的抗原。 如微生物、异种血清 半抗原:又称
2、不完全抗原。是指其本身只有反应原性, 但没有免疫原性的简单小分子的抗原物质。如 某些药物(青霉素,等)、多糖、类脂。,6,目前,在中草药中发现广泛存在半抗原,如小檗碱、茶碱、丹参酮等,具有生化活性基因的化学成分都有可能成为半抗原,这些半抗原可与体内蛋白质结合成完全抗原,造成一些过敏反应。,7,抗原的特异性既表现在免疫原性上,也表现在反应原性上。,沙门氏杆菌,大肠杆菌,免疫球蛋白的结构,抗体:能与相应抗原特异性结合的具有 免疫功能的球蛋白。,抗体的产生过程: 机体免疫系统受抗原物质刺激后,B淋巴细胞被激活,增殖和分化为浆细胞,由浆细胞合成和分泌的球蛋白。,免疫球蛋白(immunoglobulin
3、,Ig)分子量范围从150,000到950,000道尔顿。分五类: IgG在血清中含量最高,达7580%,是抗感染 的主要抗体; IgM是五类免疫球蛋白中分子量最大的,为 五聚体,是对一个抗原作出反应时产生的 第一个抗体; IgA在黏膜表面、乳腺、泪腺形成,主要参 与局部的免疫反应; IgD在血清中含量很低; IgE在血清含量最少。,免疫球蛋白,IgG,IgM,IgA,IgD,IgE,动物血清中产生抗体的时间示意图,抗原刺激的第一至三周,IgM生成;抗原再刺激后, Ig将取代IgM,抗体研究的发展阶段: 以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表,用抗原免疫动物来获得多克隆抗体。 以197
4、5年Milstein & Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb)为代表。 以1994年Winter,创建了噬菌体抗体库(repertoire of antibodies displayed on phages)技术,以基因工程方法制备抗体为代表。在此基础上发展成抗体工程。,多克隆抗体: 一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。 单克隆抗体(Monoclonal antibody McAb): 由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。,多克隆抗体和单克隆抗体,McA
5、b(Monoclonal antibody,单克隆抗体): 将在体外不能长期传代的抗体产生细胞(如Balb/C小鼠的免疫脾细胞)与在体外能迅速增殖并带有抗药标记的骨髓瘤细胞(如小鼠的NS-1或SP2/0)在聚乙二醇(PEG)作用下融合,然后利用抗药性标记和经稀释法选出单个产生抗体的杂交瘤细胞,再用血清学方法证实其与抗原结合的特异性和亲和力。这样的杂交瘤细胞能长期传代同时分泌针对单一抗原上单一抗原表位的抗体,称为McAb(第二代抗体)。,二. 单克隆抗体的制备,二.单克隆抗体的制备,单克隆抗体制备过程图解,单克隆抗体制备过程图解,一.抗原与动物免疫 1.抗原选择 完整细胞(肿瘤细胞);可溶 性蛋
6、白质或多肽; 2.免疫动物 小鼠(Balb/C,鼠龄6-8周)或 大鼠 (Lou);,3.常用的骨髓瘤细胞系 SP2/0,P3.653细 胞,都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)的缺乏株。 4.免疫方法: 体外免疫法;体内免疫法,体内免疫法 - 颗粒性抗原(如细菌、细胞)的免疫原性强,可不加佐剂,可溶性抗原则按每只小鼠10-100ug抗原与弗氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内. 弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant,FCA): 由矿物油(如降脂烷或液体石蜡等)、乳化剂和灭活的分枝杆菌组成的乳化佐剂。 弗氏不完全佐剂不含分枝杆菌,免疫佐剂(adjuvant )
7、 (1)定义:先于抗原或同时与抗原混合注射机体 可增强抗原的免疫原性的物质。 (2)应用 弱免疫原性物质; 免疫原剂量不足。 (3)佐剂种类 1)油性乳剂弗氏佐剂(Freund adjuvant) 2)无机化合物 3)微生物及其产物 4)脂质体 5)细胞因子,二.细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 1.细胞融合的基本方法(PEG促融) 脾细胞 骨髓瘤细胞(“永久”细胞) (1108) (23107) 聚乙二醇(PEG) 37-40 2mins 融合细胞(杂交瘤细胞) 用作细胞融合剂的聚乙二醇(PEG)一般选用MW4000,常用浓度为50,pH8.0pH8.2 。可加入二甲基亚砜(DMSO)。,2
8、002年12月神舟4号飞船搭载B淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验,原理: 细胞进行融合时,培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞,还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。,2、杂交瘤细胞的选择性培养 常用的选择培养基为HAT培养基。 次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A能阻断DNA合成)、 胸腺嘧啶(T)。 脾细胞具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶,用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧
9、啶(T)合成DNA,使杂交瘤细胞得以生长。,HAT选择培养机制,主要途径 糖 氨基酸 氨甲喋呤(A) 次黄嘌呤(H) GMP 核苷酸 DNA HGPRT 核苷酸前体 TK(胸苷激酶) 胸腺嘧啶核苷(T) dTMP,HAT培养基: H 为次黄嘌呤,是HGPRT的底物,为DNA合成提供原料(核苷酸旁路合成原料) A 可阻断正常的DNA合成(嘌呤及TMP合成受抑制) T 在胸苷激酶(TK)的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸,为DNA合成提供原料,含有饲养细胞的24/96孔板内悬浮培养,23天换液一次(HAT的培养液7天内),第714天改用HT培养液(对照阻的骨髓瘤细胞已死亡)14天以后用普通的RPMI164
10、0完全培养液。 常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。 89天可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测,筛选出产生抗体的阳性克隆.,培 养 板,B细胞杂交瘤的技术流程,三.筛选阳性克隆与克隆化 1.筛选方法: 免疫酶技术 放射免疫技术 免疫荧光技术,(1)免疫酶技术,原理:将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合的技术。酶与抗体或抗原结合后,既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性,也不影响酶本身的酶学活性,在相应而合适的作用底物参与下,使基质水解而呈色,或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型,从而表明某种抗原或抗体的存在。,(2)免疫荧光技术,原理: 将抗原抗体反应的特异性
11、和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物,与已知的抗体(或抗原)结合,然后将荧光素标记的抗体或抗原作为标准试剂,用于检测和鉴定抗原或抗体。 免疫荧光技术用于细胞抗原的抗体检测,特别是检测患者活检组织标本。,(3)放射免疫技术,原理:将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合,以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。 放射免疫测定原理示意图,2.克隆化 为提高筛选出来的阳性克隆的稳定性,将单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。 有限稀释法:通过一系列稀释,使每个细胞培养孔平均只含一个细胞,而分离细胞 软琼脂法:将杂交瘤细胞悬液分散在半固体营养琼脂糖上,使呈单个
12、细胞定位生长繁殖,以达到克隆化的目的。,四.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 1. 杂交瘤细胞借助染色体分析鉴定 多数为端着丝粒染色体,染色体数目 接近两种亲本细胞染色体之和。 2. 抗体鉴定 Ig类和亚类鉴定:免疫扩散或 ELISA法 亲和力鉴定,抗体类别鉴定(Ig类和亚类鉴定) 抗体分子因有大小、带电量、溶解度及其与抗原的作用不同,可分为不同的类和亚类。 IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4) IgA(IgA1、IgA2) IgM(无) IgD (无) IgE (无),1)免疫扩散,指可溶性抗原与相应抗体在液相中特异结合后,形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀线现象。 单向免疫扩散
13、双向免疫扩散,(2)酶联免疫吸附法(ELISA),原理:先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面,再将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应,用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分,最后加入酶反应底物,根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。,ELISA,ELISA,五.单克隆抗体的工业化生产 单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺过程。 1.杂交瘤细胞的大规模培养 生物反应器:气升式发酵罐,中空纤维培养 罐,微囊发酵罐 培养基:牛淋巴液,血清,2.单克隆抗体的大量制备的方法 体外培养法 (收获10-400ug
14、/ml抗体) 酶标板上培养 微载体悬浮培养(固体颗粒用DEAE-Sephadex A50等材料)。 动物体内诱生法 用0.5ml降脂烷/液体石蜡注入腹腔,然后注射1106杂交瘤细胞,再 收获52Omg/ml抗体。,支原体污染!,3.单克隆抗体(McAb)的纯化,纯化单克隆抗体流程(大鼠),单抗纯化方法: 超滤法 盐析法 离子交换法 凝胶过滤法 HPLC法等,三.单克隆抗体药物的现状,250多种抗体类药物在临床试验中 1/3已进入三期临床 1/4已通过临床III期试验 美国市场上有13种治疗用的抗体药物 抗体药物的销售额 97-99年由4.68亿美元增长到13亿美元 03年抗体类药物总销售额达到
15、50亿美元,抗体药物市场销售额,2011,全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体 正在进行临床试验的抗体公司(38家):,Abgenix Alexion Pharm Altarex Applied Molecular Evolution BASF Biogen BioTransplant CAT(Cambridge Ab Tech) Celltech Centeon Centocor (Johnson & Johnson),Elan Elsai Eli Lilly Genzyme Transgenics Genentech Genmab Hoffman-La
16、Roche ICOS Pharm IDEC Pharm/Mitsubishi ImClone Sys Immunotech Kanebo Knoll Pharm,LeukoSite Medarex Medimmune Norvartis Ortho Biotech Pasteur-Merieux Progenics Protein Design Lab Schering SmithKline Beecham Tanox Biosystems Techniclone Xoma Zenyaku,当前美国治疗性抗体市场,ReoPro (J&J, Centocor,Lilly) 1994/$461 M
17、 Abciximab,鼠 抗GPIIb/II抗体,防止血小板凝集 凝血性心血管疾病 - AMI, 不稳定型心绞痛 Rituxan (IDEC/Genentech/Roche) 1997/$303 M Rituximab, 嵌合 抗CD20抗体 非霍奇金氏淋巴瘤 Herceptin (Genentech) 1998/$204 M Trastuzumab人源化 抗HER-2/Neu抗体 HER-2 过量表达乳腺癌 Synagis (Medimmune) 1998/$285 M Palivizumab 人源化 抗-RSV F 糖蛋白抗体 小儿RSV感染,当前美国治疗性抗体市场,Remicade (C
18、entocor) 1998 $130 M Infliximab 嵌合 抗TNF-抗体 局限性肠炎,类风湿关节炎 Zenapax (PDL, Roche) 1997 $130 M Dacliximab,人源化, 抗Tac (IL-2 Receptor )抗体 移植排斥 Orthoclone OKT3 (Ortho Biotech) 1998 $60 M Muromonab 鼠 抗CD-3 (T cells)抗体 移植排斥 Simulect (Novartis) 1998 $54 M Basiliximab 嵌合 抗CD25 (IL-2 Receptor) 抗体 移植排斥 ,中国抗体研究现状,单抗
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