copd发病方法机制与主要研究方法 ppt课件.ppt
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1、阻塞性肺气肿的发病机制,正常,正常,COPD,阻塞性肺气肿,是气道远端部分膨胀(包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺泡)并伴有气腔壁的破坏、肺弹性减退及肺容量增大的一种疾病。,蛋白酶,蛋白酶抑制剂,CD8+ 淋巴细胞,吸烟 O2 / H2O2 / HO,肺泡巨噬细胞吞噬功能下降 嗜中性粒细胞化学趋动因子 白介素 (IL-8),T N F - 介质(LTB4),嗜中性粒细胞,嗜中性细胞弹性蛋白酶 组织蛋白酶 基质金属蛋白酶,-抗胰蛋白酶 SLP1 TIMPS,肺泡壁破坏 (肺气肿),发病机制,树突状细胞,破坏弹力纤维,气流受限,粘液分泌增加,纤毛运动减退,反复感染,气道慢性炎症,气道重塑,发病
2、机制, 气道炎症 氧化应激 蛋白酶/抗蛋白酶失衡 自主神经系统功能紊乱(如胆碱能神经受体分布异常),气道炎症,COPD中的炎症细胞 树突状细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 T淋巴细胞 B淋巴细胞 嗜酸粒细胞 上皮细胞 成纤维细胞,参与COPD的炎症介质 趋化因子: LTB4 吸引中性粒细胞和T淋巴细胞 IL-8 吸引中性粒细胞和单核细胞 前列腺素 致炎因子: TNF-、IL-6 放大炎症反应 生长因子: 转化生长因子- 诱导小气道纤维化 MCP-1. GM-CSF . ET-1. PAF 等可能参与,COPD: 以炎症为核心的 多因素构成的疾病,炎症细胞数量/活性增加 促炎转录因子.核因子-B(NF
3、-B) 炎症介质水平升高: IL-8, TNF-, LTB-4 和氧化剂 引起蛋白酶/抗蛋白酶失衡,杯状细胞增生/ 化生 粘液腺肥大 平滑肌质量增加 气道纤维化 肺泡破坏,营养状态差 BMI降低 骨骼肌损伤 虚弱无力,失去肺泡附着 弹性回缩力丧失 平滑肌收缩增强,粘液分泌过多 粘液纤毛运输减少 粘膜损伤,氧化应激,香烟烟雾和其它吸入颗粒能产生氧化物:H2O2 ,脂质过氧化物,CO ,NO COPD患者内源性抗氧化物产生下降 COPD患者呼出气浓缩物、痰、血中氧化应激的标志物(如过氧化氢和 8- isoprostane)增加 血浆抗氧化能力下降 氧化应激对肺组织的不利影响 激活炎症基因 使抗蛋白
4、酶失活 刺激粘液高分泌 导致糖皮质激素的抗炎活性下降,蛋白酶/抗蛋白酶失衡, COPD患者肺组织中分解结缔组织的蛋白酶和 对抗此作用的抗蛋白酶之间存在失衡 弹性蛋白是肺实质结缔组织的主要成分,蛋白 酶引起弹性蛋白破坏,是导致肺气肿的重要原因,并且是不可逆的 肺气肿的形成主要与由巨噬细胞及其源性的基质金属蛋白酶起主导作用,COPD病理学特点,气道 炎症,粘膜纤毛 功能障碍,气流 阻塞,气道 结构 改变,炎症细胞数量/活性增加: - 树突状细胞 - 巨噬细胞 - 中性粒细胞, - CD8+ 淋巴细胞 IL-8, TNF, LTB4提高 粘膜水肿,肺泡破坏 上皮增生 腺体过度增大 杯状细胞变形 气道
5、纤维组织增生,粘液过度分泌 粘液粘性增加 减少纤毛转运 粘膜损伤,平滑肌收缩 胆碱能释放增加 气道高反应性 弹性收缩降低,一、肺脏的变化,肉眼:肺脏过度膨大,失去弹性,灰白色。,镜下:见肺泡壁变薄、胀大,破裂或形成大泡,血供减少,弹性纤维网破坏,气道重塑,管腔变窄。,一、肺脏的变化,气道改变,二、肺血管、心脏改变,小血管管腔变窄、闭塞。 后期发展成肺心病时有右心改变。,通气功能障碍:肺顺应性,RV,FEV1,MVV,最大呼气中期流量 。 换气功能障碍:通气/血流分布不均匀,三、肺功能变化,COPD主要研究方法,小鼠 COPD 模型建立方法 小鼠肺功能检查 血浆、BALF 中细胞因子的 ELIS
6、A 测定 肺组织的免疫组织化学分析 待测标本的收集和处理 气道、肺组织病理形态学分析 蛋白电泳wester blot 琼脂糖凝胶电泳 RNA的提取及测定和Q-PCR 小鼠气道上皮细胞的提取与培养 小鼠腹腔巨噬细胞的提取 细胞培养基本技术胞培养基本技术,.,小鼠 COPD 模型建立方法,将小鼠随机分为COPD模型组和正常对照组,模型组(cigarette smoke exposed groups,简称 CS 组)小鼠每天熏烟两次,每次2 h,香烟剂量为10支h。两次间隔时间为3-4小时)正常对照小鼠(normal control groups,简称正常组)不作任何干预,各组大鼠在相同环境下自由饮
7、水和摄食模型制备期间,每星期称量一次体质量,每个月检测一次小鼠肺功能。对照组小鼠不做任何干预。熏烟满6个月后,行肺功能检测、气道、肺组织病理形态学分析 、蛋白的检测、血浆和BALF 中细胞因子的 ELISA 测定、肺组织的免疫组织化学分析(熏烟装置包括熏烟箱;通风装置;和监测熏烟箱内的温度,湿度,和气体(氧气,CO)浓度监测装置。),小鼠肺功能检查,烟雾暴露停止后,使用小鼠肺功能仪检测小鼠肺功能,测量吸气峰流速(PIF),吸气阻力(RI),肺动态顺应性(Cdyn)等,具体步骤:1%戊巴比妥(0.1ml/g)腹腔麻醉小鼠.固定、备皮、消毒后剪开皮肤,轻柔钝性分离暴露气管,在甲状腺处剪开气管,插入
8、气管插管,放入体描箱,并连接小动物肺功能仪进行肺功能测定,潮气量(10ml/kg),吸气压力8-12cmH2O。呼吸120次/min,吸呼比10:15.待小鼠与呼吸机完全协调后,测定肺通气功能。记录数据, 为保证肺功能数据质量,操作均由同一人进行.,小鼠肺功能评价,小鼠血浆的收集和血细胞涂片的制备,经小鼠眼球取出血液。抗凝血(枸椽酸钠抗凝)平衡后,在 4以 1500rpm离心 10min,将血浆分装后,-80保存备用。将 0.5ml 血细胞装于 15ml 用 3ml 双蒸水室温下悬浮二次(70 sec、30 sec)立即离心(条件同上), 倒除血红蛋白等成份后, 将细胞悬浮于 1ml 培养液中
9、(MEM, DMEM,199 均可), 吸取其中 100ul,用离心涂片机以 1500rpm离心 6min 制备细胞涂片 6 张以上,过夜后用锡铂纸包存于低温冰箱(-30),支气管肺泡灌洗液的收集及计数,每组小鼠经气管插管后,用无菌生理盐水灌洗2次,每次0.8ml,收集得到BALF,之后,打开小鼠胸腔,区肺组织保存于液氮之中待用。将收集的回收BALF(80%一90%)于43000r/min离心10min.收集上清液保存于-80 冰箱中;将下层细胞均匀涂布于载玻片,经固定,H-E染色。光学显微镜下进行分类计数,计数200个,计算其中的中性粒细胞,巨噬细胞,淋巴细胞等各占的百分比。,小鼠肺组织病理
10、学检查,准备小鼠肺组织石蜡切片 将小鼠腹腔麻醉后固定实验台上,取出血液标本后,打开胸腔,轻轻剪取右肺其中一小叶肺组织,于生理盐水中快速漂洗表面血迹后,置于4%多聚甲醛中进行固定24小时后取出,用清水快速将残留的甲醛冲洗干净,将标本进行梯度脱水后石蜡包埋,将包埋的肺组织切成月4um的薄片,置于40 的温水中展开,用铺好胶的玻片将其捞起,将粘有蜡片的玻片在43 烤片机上烤2H,待切片完全干透粘劳后,4 保存备用。,H-E染色,1.二甲苯10min x2次 2,.无水酒精5min x2次 3.95%酒精5min 4.自来水洗5min 5.苏木素染液浸 5-10s 6.自来水冲洗直至发蓝为止 7.盐酸
11、酒精(比例为1:99)洗10-20s 8.自来水冲洗10s 9.70%酒精5min 10.80%酒精5min 11.90%伊红乙醇洗5-10min 12.95%酒精5min 13.95%酒精10min 14.无水酒精10min x2次 15二甲苯10min3次 16.采用中性树胶封片 17.在37 烤箱中过夜 18显微镜下观察,小鼠肺组织病理学观察及形态,小鼠肺组织病理学观察及形态,免疫组化实验原理与意义,免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通 过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新 技术。它把免疫反应的特异性、组织化
12、学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧 光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋 白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等),1. PBS缓冲液(ph7.27.4);NaC137mmol/L,KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 20.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,ph6.0,1000ml):柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。 30.5mol/L EDTA缓冲液(ph8.0):700ml水中溶解186.1g EDTAph7.0-7.4适合光学纤维标本,试 剂,气道粘膜石蜡切片的免疫
13、组化,免疫组化染色SP法 1) 脱蜡、水化 2)PBS洗2-3次各5分钟 (3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟 (4)PBS洗2-3次各5分钟 (5)抗原修复 (6)PBS洗2-3次各5分钟 (7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体 (8)滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时 (9)4过夜后需在37复温45分钟 10)PBS洗3次每次2分钟 (11)滴加抗45-50l,室温静置或371小时 (12)抗中可加入0.05%的 tween-20. (13)PBS洗3次各5分钟 (14)DAB显色5-10分钟,在显微镜下掌握染色程度 (15)PB
14、S或自来水冲洗10分钟 (16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化 (17)自来水冲洗10-15分钟 (18)脱水、透明、封片、镜检,免疫组化SABC法,(1) 脱蜡、水化 (2)PBS洗2次各5分钟 (3)用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2,室温封闭5-10分钟,用蒸馏水洗3次 (4)抗原修复 (5) PBS洗5分钟 (6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体 (7)滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时 (8)PBS洗3次各2分钟 (9)滴加生物素化抗,20-37 20分钟 (10)PBS洗3次各2分钟 (11)滴加试剂SABC 20-30 20分钟 (12) PB
15、S洗4次各5分钟 (13) DAB显色:试剂盒或自配显色剂显色 (14)脱水、透明、封片、镜检,免疫组化问题解答,1、染色过强 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间:室温1小时或4度过夜 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度 DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟,以显微镜下观察为准 2.非特异性背景染色 原因 解决方法 a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟 b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长 c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭 d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 3染色弱
16、原因 解决方法 a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时,间不能少 于60分钟 b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂 c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液 使试剂稀释 (应防止切片干燥) d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜 e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟 ,4.染色阴性 原因 解决方法 a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照 b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果 c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误,肺组织蛋白提取,将冻存已称重的肺取出置于冰上,按900ul/mg的比例加入肺
17、组织裂解液,使用肺组织匀浆器匀浆至均匀,然后按250ul/ml的比例加入5xLaemmile Sample Buffer匀浆至果冻样,置于冰上,用超声破碎仪(强度为28%,4s on, 4s off,共8分钟),然后离心30min(4 ,12000rmp/min)取上清液并。分装与1.5ml离心管中,置于-80 冰箱中保存。,肺组织蛋白浓度测定,1.按试剂盒说明书配置工作液和相容性试剂溶液 2.标准品空白,标准品,样品空白,和未知样品各加入9ul在孔中心(两个重复) 3.每孔加入4ul相容性试剂溶液。 4.摇床1min,37 孵育15分钟。 5.每孔加入260ul工作液,摇床1min,37 孵
18、育30min。 6室温冷却5min 7.使用标准品空白作为空白对照,562nm测吸光度(注意:在室温,吸光度以0.25%/min的速率上升)。 8.所有未知蛋白样品的复孔的562nm吸光度值减去样品对照复孔的吸光度值。 9.用经过空白对校正的BCA蛋白标准品562nm吸光度值与其浓度(ug/ml)来绘制标准曲线,用标准曲线计算蛋白样品的浓度。 10.将所有的蛋白样品按上样量30ug计算体积,用裂解液补齐体积后,加入适量的5xloading buffer 后,将蛋白在沸水中5min,是蛋白变性,置于冰上5min待用。,肺组织蛋白浓度测定,1.制备分离胶和浓缩胶 2.电泳:120V 10min ;
19、150V 50min 3.转膜:300mA ,70min 4.封闭,5%MILK-TBST中进行封闭,常温下2小时,或者4 过夜, 5.一抗孵育,常温2H,TBST洗3次,每次10min 6.二抗孵育,常温1H, TBST洗3次,每次10min 7.成像。 8.扫描wester blot 条带,用Imagej图像分析仪软件分析免疫印迹的灰度值。,分离胶,浓缩胶配置,血浆、BALF 中细胞因子 ELISA 测定,酶联免疫分析技术(ELISA) 酶联免疫分析的基本原理和方法类型 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上,并保持其免疫活性。测定时,将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸
20、附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色,进行定性或定量测定。 ELISA可用于测定抗体,也可用于检测抗原。常用方法,ELISA 测定三种类型,间接法 此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体,加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后,加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定,酶联免疫分析技术(ELISA)间接法,操作步骤: 用已知抗原包被固相载体; 加待检标本,经过温育(372h),使相应抗体与固相抗原结合。洗涤,除去无关的物质; 加酶标抗抗体再次温育(372h)与固相载体上抗原抗体复合物结合;洗涤,除去未结合的酶标
21、抗抗体; 加底物显色。终止反应后,目测定性或用酶标仪测光密度值定量测定。,酶联免疫分析技术(ELISA)间接法,1.包被:用包被缓冲液将已知抗原稀释至110gml,每孔加0.1ml,4过夜。次日洗涤3次。 2.加样:加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 3.加酶标抗体:于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37孵育3060分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。 4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml,371030分钟。 5. 终止反应:于各反应
22、孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。,双抗体夹心法,双抗体夹心法 此法常用于测定抗原。 将已知抗体吸附于固相载体加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤,加入酶标抗体和底物进行测定。 见下图:,双抗体夹心法,操作步骤: 用已知特异性抗体包被固相载体; 加待检标本,经过温育使相应抗原
23、与固相抗体结合;洗涤,除去无关的物质; 加酶标特异性抗体,与已结合在固相抗体上的抗原反应;洗涤,除去未结合的酶标抗体; 加底物显色。终止反应后,目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。 此法适用于多价大分子抗原的检测,而不能用于测定半抗原等小分子物质。,双抗体夹心法,用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被:用0.05M PH9,碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml,在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。 2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空
24、白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml,37孵育0.51小时,洗涤。 4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml,371030分钟。 5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对
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