结构与性能2.ppt
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1、第二章 蛋白质的理化性质及其 分离和提纯,一、氨基酸的性质,(一)两性与等电点,水溶液中存在如下平衡:,具有酸碱性,两性离子,pH=pI时,以偶极离子形式存在,pHpI时,以阴离子形式存在,pHpI时,以阳离子形式存在,不同的氨基酸等电点不同,在一定酸度的溶液中,它们荷电程度不同,分子大小不同,在电场中的移动速度也就不同。借此可以进行氨基酸的电泳分离。,纸电泳 (Paper electrophoresis),练习:,现在有四个氨基酸:苯丙氨酸pI=5.5、脯氨酸pI=6.3、天冬氨酸pI=2.8和赖氨酸pI=9.7,请问在以下pH条件下进行电泳,各氨基酸的主要存在形式是什么?在外电场作用下,移
2、向阳极还是阴极? 苯丙氨酸 脯氨酸 门冬氨酸 赖氨酸 (1)pH=7.0 (2)pH=6.0 (3)pH=5.0 (4)pH=2.0,正 阴极 正 阴极 负 阳极 正 阴极,负 阳极 负 阳极 负 阳极 正 阴极,正 阴极 正 阴极 正 阴极 正 阴极,负 阳极 正 阴极 负 阳极 正 阴极,基于aa所带基团均可解离; 酸碱滴定法; 得到弱酸弱碱曲线; 根据aa上可解离基团的pK值计算等电点: pK:解离常数。,pI的测定,以甘氨酸为例:,等电点的计算,由式可知解离常数:,两边取负对数: -lg H+ 2 = - lg K1 - lg K2 -lg H+ = pH - lg K1 = pK1
3、- lg K2 = pK2 2 pH = pK1 + pK2 令 pI为等电点时的pH,则 pI = ( pK1 +pK2) Gly:pI = (2 .4 + 9.6) = 5.97,由此可知: 等电点相当于该aa两性离子状态两侧 基团pK值之和的一半。,对侧链R基不解离的中性氨基酸: pI=1/2( pK1+ pK2) 即:等电点pH值与离子浓度无关,只取决于兼性离子两侧基团的pK值。,对有三个可解离基团的氨基酸:,如:酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算: a、先写出其解离公式; b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平 均值。,如:天冬氨酸,如赖氨酸:,(二) 氨基酸的脱羧反应,(三)与亚硝酸反
4、应,(四)受热反应,(1)-氨基酸受热,二肽(少量),交酰胺经盐酸或碱处理,可转变成二肽,(2)-氨基酸受热,(3)或-氨基酸受热,生成较稳定的五元环或六元环的内酰胺。,(4)氨基与羧基相隔5个或5个以上碳原子,(五)与茚三酮反应,大多数-氨基酸与茚三酮反应呈蓝紫色,这是鉴别-氨基酸最灵敏、最简便的方法。,-氨基酸与茚三酮反应所生成蓝紫化合物在570nm有强吸收,可进行比色分析,其吸收强度与氨基酸的含量成正比,因此可作氨基酸的定量分析。,天然蛋白质分子的20种氨基酸,以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在280nm左右,以色氨酸吸收最强。 可利用此性质采用紫外分光光度法测
5、定蛋白质的含量。 紫外吸收性受溶液pH的影响。,(六)紫外吸收性质,二、蛋白质的性质,(一)两性电离与等电点,含有羧基及氨基,因此可以两性电离,存在等电点(pI),等电点时,蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、膨胀性都最小,在电场中不移动。 同样,当溶液pHpI时,蛋白质所带正、负电荷相等;当溶液pHpI时,蛋白质带净负电荷;当溶液pHpI时,蛋白质带净正电荷。,蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。,(二)胶体性质,蛋白质颗粒的直径1100nm,属于胶体溶液。因此,蛋白质具有亲水溶胶的性质。,布朗运动、弱丁达尔效应、不能透过半透膜、吸附,蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜,
6、物理因素:加热、高压、搅拌、X-射线、紫外线、超声波 化学因素:强酸、强碱、脲、重金属盐、有机溶剂、生物碱等,1、变性,在某些物理或化学因素的作用下,蛋白质严格的空间结构被破坏(不包括肽键的断裂),从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变。 实质:破坏次级键,改变其构象,(三)蛋白质的变性与沉淀,变性蛋白质的性质改变: 物理性质:旋光性改变,溶解度下降,沉降率升高,粘度升高,光吸收度增加等; 化学性质:官能团反应性增加,易被蛋白酶水解。 生物学性质:原有生物学活性丧失,抗原性改变。,蛋白质变性的可逆性: 蛋白质在体外变性后,绝大多数情况下是不能复性的; 如变性程度浅,蛋白质分子的构象未被严
7、重破坏;或者蛋白质具有特殊的分子结构,并经特殊处理则可以复性。,核糖核酸酶的变性与复性,天然构象,蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀,变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀,但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。,2、沉淀,特点:盐析法沉淀的蛋白质没有变性,去盐后活性恢复。,沉淀蛋白质的方法: (1) 盐析:在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出。 实质:破坏蛋白质分子的水化膜和中和其所带的电荷 盐析浓度:盐析所需盐的最小浓度 常用盐析电解质:(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl 溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好 通常不会引起
8、蛋白质的变性,盐溶,分子在等电点时,相互吸引,聚合沉淀,加入少量盐离子后破坏了这种吸引力,使分子分散,溶于水中,盐析,蛋白质脱去水化层而聚集沉淀,盐析(NH4)2SO4),盐析,向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出,分段盐析: 半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的蛋白,而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的蛋白。因此,使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。,(3) 重金属盐沉淀: 铅、铜、汞等重金属的盐类能使蛋白质凝结变性,所以能使人中毒。万一不慎误服了重金属离子,可立即喝大量的牛奶、鸡蛋清等来缓解毒性,以减少人体内蛋白质中毒的程度。,(2) 有机溶剂沉淀 凡能与水
9、以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是: 脱水作用; 使水的介电常数降低,蛋白质溶解度降低。,加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。 凝固的蛋白质一定发生变性。,3、凝固,(四)蛋白质的颜色反应,1、黄色反应,2、缩二脲反应,与硫酸铜的强碱溶液呈红紫色。(肽键),加浓硝酸,沉淀,再加热,变姜黄色。(苯环),3、茚三酮反应,与茚三酮溶液共热,呈蓝紫色。(-氨基酸),4、米隆反应,加入米隆试剂(汞和亚汞的硝酸及亚硝酸盐混合物),先析出沉淀,再加热时,沉淀变为砖红色。(酪氨酸酚基),三、蛋白质分离提纯的一般原则,关于蛋白质我们已知什么? 如果一个蛋白质过去已
10、从不同的来源纯化得到,它的很多信息可应用到新来源的蛋白质。例如:分子的大小、定位、等电点、疏水性及翻译后的修饰等,应该保持相同。如果蛋白质是一个酶或受体,则根据该蛋白质与底物或配体的关系可以制定出一个成功的纯化策略。,蛋白质需要有多纯? 蛋白质纯化的程度通常取决于它最后的用途。如果蛋白质是供研究用的,则它应该是非常纯的,如果蛋白质是用于工业的,部分纯化就足够了。,纯化蛋白的量要多少? 对于活性研究用的,只需要比较少量的活性蛋白质;而对于进行结构研究用的蛋白质来说,则需要比较大量的高纯度蛋白质。,蛋白质应该如何进行鉴定? 在蛋白质纯化过程中,为了进行蛋白质的追踪,必须有一个快速、重复性好而且灵敏
11、的鉴定方法。此鉴定方法还应该是经济的,能在小体积下进行操作,而且不要求采用昂贵的仪器。,纯化时间应该多长? 纯化步骤应该很快,以减少蛋白质活力的丧失和蛋白质降解等。一般来说蛋白质的量在纯化过程的各步中均会有损失,因此应当尽量减少纯化步骤,以期获得最大的产率。,蛋白质分离提纯的一般程序,一般程序可分为前处理、粗分级和细分级三步:,前处理:分离提纯蛋白质,首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,不至于丢失其生物活性。 不同的组织或细胞可用不同的方法破碎; 组织或细胞破碎以后,选择适当的介质(一般用低浓度的缓冲液)把所要的蛋白质提取出来。,有时在肌肉组织中抽提
12、时也用稀碱(肌肉中含有乳酸); 在提取膜蛋白或包含在体内的蛋白质时,可加入表面活性剂以增加溶解度。 由于在细胞中普遍存在各种蛋白质水解酶,有时需低温操作和加一些相应的蛋白酶抑制剂、螯合剂可防止蛋白质的降解。,粗分级:当蛋白质混合物提取液获得后,选用一套适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白质分离开来。 一般这类的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白质溶液。,细分级:样品的进一步提纯。一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。 必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电聚焦电泳等作为后续的提纯步骤。,结晶:蛋白
13、质分离提纯的最后步骤。 尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性,但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯,而重结晶又可除去少量的夹杂蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质,因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质的纯度越高、溶液浓度越浓就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态,这可以借控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH等方法来达到。,重结晶:将含有杂质的固体有机物在加热下溶解在适宜的溶剂中,使成饱和溶液。趁热过滤,去除其中的不溶物后,冷却使欲纯制的有机物重新结晶出来。,蛋白质的分离,根据蛋白质
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