【大学课件】基因分析的基本策略.ppt
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1、从上世纪70年代以来,与DNA、RNA操作相关的各种分子生物学技术不断发展,到目前已经形成了一个庞大而复杂的技术体系。基因操作已成为医学研究的重要手段。简单地说,基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技术。 本章主要讨论如何对基因进行定性、定量分析;在随后的2章里分别介绍基因功能研究的技术和基因工程的有关内容。,第六章 基因分析的基本策略,http:/ 2、基因的染色体上定位:原位杂交技术 3、研究基因在基因组中的拷贝数:Southern Blot 4、研究基因表达水平:Northern Blot、逆转录实时PCR技术 5、研究基因表达产物的水平:Western Blot、流式细胞仪( F
2、ACS ),对一个已知或未知基因的内容进行研究步骤:,http:/ 利用DNA定性、定量分析可从不同角度 对基因和基因组进行研究,一、DNA序列测定可以揭示基因和基因组一级结构变化,DNA测序技术: 1、双脱氧链终止法(Sanger法) 2、化学裂解法 3、PCR测序技术 4、全自动DNA测序仪 这些技术的发明,都依赖于高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,http:/ 如果在DNA的合成反应中,加入一种少量的ddNTP,则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止,生成一系列长短不一的核苷酸链。在4组独立的DNA合成反应中,分别加入4种不同的ddNTP,结果生成的4组核苷酸链将分别终止于各个A,G,C,
3、T的位置上。对这4组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,就可读出序列。,双脱氧测序方法原理,http:/ 1、先将DNA的末端之一标记放射性同位素(32P、35S), 2、再将DNA样品分别进行多组具碱基特异性、随机的、不完全的化学修饰; 3、采用修饰碱基敏感的特异化学试剂在修饰碱基位置断开DNA链; 4、通过具有可分辨链长短仅一个核苷酸之差的聚丙烯胺凝胶电泳,将DNA断裂片段按分子大小分离开 5、根据放射自显影胶片上显示的末端标记片段分布情况,直接读出DNA序列。,化学裂解法(Maxam-Gilbert) 1977,http:/ 碱基修饰 碱基修饰 主链断裂 断裂点 试剂 反应 试剂
4、G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G/A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C/T C 肼(加盐) 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C,在化学修饰反应中,通过控制反应温度和反应时间,只有一小部分碱基被修饰,随后进行断裂反应也是定量。,http:/ GATCACTACTG,5*G,5*GA,5*GATCA,5*GATCACTA,5*GATCACTACTG,5*GAT,5*GATC,5*GATCAC,5*GATCACT,5*GATCACTAC,5*GATCACTACT,5*GATC,5*GATCAC,5*GATCACTAC,G,G+A,C+T,C,G A/G C/
5、T C,5*G,5*GA,5*GAT,5*GATC,5*GATCAC,5*GATCACTAC,5*GATCA,5*GATCACT,5*GATCACTA,5*GATCACTAC,5*GATCACTACT,5* GATCACTACTG,硫酸二甲酯,甲酸,肼,肼(加盐),http:/ 1987年发明了一种准确快速的DNA测序方法,即激光测序法和配套的自动测序仪。(用荧光染料结合引物)。随后又发明了终止标记系统法。,http:/ 2、通过DNA序列分析,可以鉴定基因和基因组变异。 3、通过DNA序列分析,可以鉴定分析人工重组的基因。 4、通过DNA序列测定对定点突变进行确认。,DNA序列测定的意义,h
6、ttp:/ blot 检测基因拷贝数变化,Southern blot 印迹杂交是指DNA与DNA的杂交,将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定的固定支持物上,然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。 1975年英国爱丁堡大学的Southern建立了该方法, Southern印迹杂交由此得名。,http:/ blot步骤,(1)待测核酸样品的制备:提取基因组DNA,并用适当的限制性内切酶消化水解基因组DNA,成大小不一的DNA片段。 (2)待测DNA样品的电泳分离。 (3)凝胶中核酸的变性:DNA在制备与电泳过程中DNA片段始终保持双链结构。电泳结束后DNA变性并转移到适当的固定支持
7、物上才能进行Southern blot。 变性通常用碱变性法。,http:/ Southern 转膜:将凝胶中的DNA进行碱变性并将PH恢复中性后,即可将凝胶中DNA转移到固定支持物上。 固定支持物:硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。 转移方法:毛吸管虹吸印迹法、电转印迹法、真空转移法。 (5)已知序列的DNA探针的制备,http:/ Southern杂交:在将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交前,必须先进行一个预杂交的过程。因为能够结合DNA的膜同样可以和探针DNA结合,在进行杂交实验前,必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。 (7)杂交结果的检测:采用核素标记的探针
8、或发光剂标记的探针进行杂交时,在杂交洗膜后,将滤膜和X线片装入暗盒,感光后,经冲洗,在X线片上可见黑色条带。,http:/ 2、通常要研究的基因序列是已知的。,Southern blot 检测基因拷贝数注意事项,http:/ 细胞内DNA复制是一个复杂过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应,PCR原理与细胞内DNA复制相似,但反应体系相对简单。 PCR反应体系: 耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物、4种dNTP、以及合适的缓冲液体系。 PCR反应的基本过程:变性、退火、延伸,http:/ 近年来,随着PCR技术的不断改进,如差异显示PCR和实时PCR
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