实例分析分子生物学技术的应用.ppt
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1、生物化学与分子生物学实验技术,课程安排:32学时,讲课:三次(1117, 1124, 1201) 实验:四个/四组?/加样器?/时间?,实例分析 分子生物学技术的应用,-以interleukin 24为例,二、基因功能研究 1.mRNA水平和蛋白质水平表达谱 2.体外生物学活性:细胞模型,调节表达水平 细胞活力、细胞增殖、细胞周期、抑瘤活性、等等 3.体内生物学活性:抑瘤活性、成血管活性、等等,内容,一、基因的基本信息:发现、序列、染色体定位、表达调控、同源性分子、修饰、降解、细胞内定位、空间结构等等,三、作用机制:信号转导途径和相互作用分子 四、应用,235 documents,IF 5.9
2、7 7.5 7.2 2.76 5.0 3.0 6 9.38 4.3 5.52 1.3 4.1 5.25 6.48,Oncogene 1995, 11: 2477-2486 Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37,mda-5,mda-6 (p21),mda-7/IL-24,mda-9/syntenin,Subtraction hybridization,一、mda-7/IL-24,Paul B. Fisher Columbia Uni,1.发现,杂交产物的克隆、筛选和测序,除去 杂交体、 过量探针、盐和小片段,Cancer Biol Ther 2003;2:S23S37,2
3、.提交序列,NCBI/Genbank,3.染色体定位,Data base analysis,Cyto Growth Factor Rev. 2003, 14: 3551,IL-10 Family,Mol Med. 2001;7(4):271-282,4.与IL-24同源的分子,一致的 (*) 保守的 (:) 相似的 (.),Cytokine Growth Factor Rev. 2003;14:3551 Immunology. 2005;114(2):166-70,NCBI Blast, KEGG,5.基因的表达调控,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,基因组文
4、库,IL-24cDNA探针,PCR,测序,启动子:GCG 启动子搜索 转录起始位点:引物延伸和作图,转录水平,启动子序列,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,AP-1: PKC-activated TF C/EBP: growth arrest and terminal differentiation associated TF,转录起始前复合物:真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直接结合,而需依靠众多的转录因子。,转录前起始复合物,拼板理论:一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。 转录因子之间互相结合,生成有活性和专一性的复合物,再与RNA聚合酶搭配而有
5、针对性地结合、转录相应的基因。,RNA聚合酶保护法,Luciferase assay system,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,NdeI-NheI是启动子转录活性的重要区域,C/EBP-b和cJUN/AP-1提高转录活性。,重要区域,nuclear lysates,arrow 1:C/EBP-b arrow 2:AP-1,J Cell Physiol. 2000;185(1):36-46,EMSA,C/EBP-b和cJUN/AP-1结合在mda-7/IL-24启动子上。,cell lysates,IFN-和MEZ单独或联合处理 不能显著改变启动子活性,L
6、uciferase assay system, NB,Oncogene. 2000;19(10):1362-8,3-UTR的ARE调节该基因在终末分化过程中的mRNA水平,ARE: AU-rich elements,Luciferase assay system,Oncogene. 2000;19(10):1362-8,7.分泌蛋白,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,Overexpression, WB,Ad.IL-24 cell lysate,Ad.IL-24 supernatant,分泌作用的抑制剂,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,WB,Cytok
7、ine Growth Factor Rev 2003;14:3551,PNGase F: endoglycanase F endo-O: 内-O糖苷酶,6. 翻译后修饰,Overexpression, WB,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,MDA-7/IL-24蛋白可被糖基化修饰,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,glycopeptidase F,L SN,7.细胞内定位,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,IFC,Mol Ther. 2004;9(3):355-67,Quantitative receptor bindin
8、g analysis,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,IL-20R2, IL-20R1/IL-20R2, IL-22R1/IL-20R2结合AP的活性高。,8.受体,J Biol Chem. 2002;277(9):7341-7,Cell surface staining assay,RT-PCR,Exp Dermat. 2006; 15: 9911004,Cancer Biol Ther. 2003;2:S23S37,RT-PCR,PC NC,Cytokine. 2008; 41: 1623,FACS,IL-22R1/IL-20R2 IL-20R1/IL-20
9、R2,Immunology. 2005;114(2):166-70,Cyto Growth Factor Rev. 2003, 14: 3551,3.前列腺 4.睾丸 5.卵巢 6.小肠 7.结肠,1. mRNA表达谱:分布在人的免疫系统,NB,二、基因功能的研究,Oncogene 2001;20:70517063.,Cyto Gro Fac Rev. 2003;14:3551,:untreated +:IFN-+ MEZ , 24 h,NB,Oncogene. 2001; 20: 7051 7063,Real-time RT-PCR,在黑色素瘤恶性发展过程中,mda-7/IL-24的mRNA
10、表达水平逐渐降低,直至完全丧失。,Pharmacol Ther. 2006;111(3):596-628,Kaplan-Meier survival analysis,Cancer Cell Inter. 2010; 10:29,2.蛋白水平:,IHC,Cytokine. 2008; 41: 1623,类风湿关节滑膜,NC,sublining mononuclear cells,endothelial cells of blood vessels,Cytokine. 2008; 41: 1623,ELISA,免疫系统:脾、胸腺、外周血白细胞 特定细胞:黑色素细胞、痣、早期黑色素瘤细胞、 平滑肌
11、细胞、 皮肤成纤维细胞、 皮肤伤口边缘和基底类成纤维细胞样细胞 肿瘤细胞:50多种,无内源性MDA-7/IL-24蛋白表达。,分布:局限性,基因在靶细胞中的过表达,Adenovirus,J Cell Physiol. 2007;210(2):549-59,CAR检测(Coxsackie-adenovirus receptors),FACS, WB,人正常卵巢上皮细胞,卵巢癌细胞,靶细胞中重组蛋白的检测,Western-blot,卵巢癌细胞,Mol Cancer. 2007;6(1):11,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215,7d,3.细胞活力,
12、Crystal violet staining,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,TRAIL:肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体,Mol Med. 2001;7(4):271-282,Trypan blue exclusion assay,Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:205215,Trypan blue exclusion assay,Ad.mda7能够降低细胞活力。,特异性抑制多种肿瘤细胞生长,4.体外抑瘤活性:细胞增殖,Cancer Gene Ther. 2006;13(11):1011-22,MTT,3H-
13、thymidine Assay,Mol Med. 2001;7(4):271-282,Cancer Res. 2006; 66(16): 8182-8191,Colony formation,缺失信号肽的突变体(SP-mda-7)具有抗瘤活性,Cancer Res. 2004; 64:29882993.,WB, MTT,Matrigel Invasion Assay, Colony formation,C8161,C8161,Cancer Res. 2004; 64:29882993.,Xenograft tumors in nude mice,5.体内抑瘤活性,SW620,Cancer Ge
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