第5章 蛋白质翻译.ppt
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1、Chapter Five Protein Translation,5.1 Basic concept, the second step of gene expression, Multiple & complex assessment, tRNA as a adapter for codon & amino acid, tRNA loading aa by aa-tRNAaa synthetase (AARS) & paracodon, tRNA recognition codon by anti-codon, codon; universal triplex codon,two of thr
2、ee reading codon,Paracodon,codon in codon, codon degeneracy; wobble hypothesis isoacceptor, codon usage (codon bias),5.2 Basic components,5.2.1. tRNA, mini RNA, 4s, (70-80 Nt), tRNA phe, 77Nt cloverleaf form, 5 arms & 4 loops, Nt more modified by methylation,-aa accept arm ; loading aa at 3 end,-DHU
3、 loop; contact with AARS,-anti-codon loop; 34th is wobble base,-TC loop; contact with 5s rRNA,-extra loop; classification marker ?, Paracodon,-由若干Nt组成,存在于tRNA不定位置上,-与AARS侧链基团的分子发生特异的“契合”,-成为tRNA准确负载氨基酸的机制之一, tRNA的”L”三维结构与功能,-二级结构中双链区的碱基堆积力和氢键,-二级结构中非双链区在“L”结构中,形成氢键结合,“L”结构域的功能,-anti-codon arm 位于”L”另
4、一端,与结合在核糖体 小亚基上的codon of mRNA配对,aa-tRNAaa,-“L”结构中碱基堆积力大 使其拓扑结构趋于稳定 wobble base 位于“L”结构末端 堆积力小 自由度大 使碱基配对摇摆,- TC loop & DHU loop 位于“L”两臂的交界处, 利于“L”结构的稳定,have GC content of 60% unusually repetitive, from several hundred to over 20,000 copies of rDNA gene rRNA synthesized in nucleolus and was stimulate
5、d by low ionic strength & Mg+2 but other RNA synthesized in niucleolpasm and stimulated by high ionic strength & Mn+2,Ribosomal genes (rDNA) are different in several ways from other nuclear gene,5.2.2. rRNA,Two-dimensional gel electrophoresis of proteins,(a) E. coil 30S subunits,(b) E. coil 50S subu
6、nits.,Kaltschmidt & Wittmann PNAS 67 (1970) f. 1-2, pp. 1277-78.), 5s RNA 与TC loop of tRNA部分同源,并可配对, In Prok.,In Euk.,AMEAMECCUGCGGUUGGAUGACCUCCUU,AMEAMECCUGCGGAAGGAUGAUUA,5.2.3. mRNA, In Prokaryote,5-end; 300Nt leading seq. (A/G-AUG),S.D seq-AUG,poly-citron,9Nt better rich A,U, In Eukaryote,mono-ci
7、stron,But mRNA of chloroplasm shows similarities to prokaryote,5.3. Genetic Code,5.3.1. Universal triplet codon,codon的特征, codon是mRNA 上连续排列的三个核苷酸序列, 并编码一个氨基酸信息 的遗传单位, codon具有生物系统的通用性与保守性(除mt), 在一个基因序列中 codon具有不重叠性和无标点性,Marshall Nirenberg (1961),But,密码子的破译 (1968. nobel prize),Stop codon 的证实,61个codons被
8、破译,(仅剩UAA,UAG,UGA?),Brenner (1961) 获得;T4 phage 头部蛋白基因的琥珀突变(amber) 证明;突变体头部蛋白较野生型的变短 推测;头部蛋白基因发生了终止突变,使蛋白质合成中断。,Garen (1965) 获得; E.coli 碱性磷酸酯酶基因(phoA)Amber突变株的大 量回复突变株 分析;回复突变株中对应“回复”的氨基酸,Stop codon 的证实,发生终止突变的原氨基酸 Trp (UGG),Ser : UCG, UCC, UCA, UCU, AGU, AGC Leu : UUG, UUA, CUU, CUC, CUA, CUG Tyr :
9、UAU, UAC Lys : AGG, AAA Gln : CAG, CAA Glu : GAG, GAA,证明:终止突变密码为 UAG (amber 琥珀突变),UAA (ocher 赭色突变) UGA (opal 蛋白石突变),5.3.2. Degeneracy of codon (密码子的简并现象),a) 简并现象的概念;,-一种氨基酸受2个以上codon编码的遗传现象,-编码一种aa的4个codon间, 仅3rd Nt 不同, 称为codon famly,例;Ser (6 codons) 1 codon family & 2 extra codons,b) 简并现象的机理, Wobbl
10、e hypothesis; 反密码子 : 密码子 1th(Nt34) : 3 rd-Nt,3 isoacceptors,1 codon family 2 extra codons,负载同一氨基酸,识别相同密码子的不同tRNA?!, Wobble base摇摆配对的机理,- tRNA的拓扑空间结构,34th摇摆位点位于拓扑结构的末端, 碱基堆积力小, 选择性配对的自由度大,- 34th摇摆位点被修饰的频率高 导致配对原则的改变,In vitro GUG(val)的第一Nt会以较低频率 与tRNAfmet反 密码子发生 “摇摆”配对, 而作为起始密码 In vivo GUGtRNAfmet whe
11、n AUG deleted only,tRNA fmet,5.3.3. Anti-codon及其两侧碱基修饰对密码子 解读的生物学意义,Xo5U (5-羟基尿苷) Cmnm5U (5-羧甲基氨甲基尿苷) mCm5U (5-甲氧基羰甲基尿苷) Xm5s2U (5-甲基-2硫代尿苷) K2C (2-赖氨酸胞苷) Com5U (5(2)-羟羧甲基尿苷) I (Inosine次黄嘌呤),m7G (7-甲基尿苷) m5C (5-甲基胞苷) m6A (6-甲基腺苷) s2C (2-硫代胞苷) (假尿苷) t6A (N6-苏氨酸羰酸腺苷) Q (Queuosine辫苷),a) Methylated Nt a
12、t anti-codon and flanked,The modification of tRNA nucleosides raises the question: Are tRNAs made with modified bases, or are the bases modified after transcription is complete?,tRNAs are made in the same way that other RNAs are made, with the four standard bases. Then, once transcription is complet
13、e, multiple enzyme systems modify the bases,b) 被修饰的Nt34的配对能力,Nt1 of anti-codon Nt3of codon,c) tRNA中anti-codon碱基修饰的意义, 限制对密码识读的随意性,以保证遗传的稳定, 提高摇摆能力,防止突变效应,以保证遗传的稳定, 修饰的碱基保证正确的读码框架, 限制+1读码, 以保证遗传的稳定,E.coli Salmonella,但在trmD3突变体中(不能修饰tRNAG37),anti-codon两侧的碱基亦被称为扩展的反密码子,tRNAmetm CA3U t6A = AUG only(防止肽链
14、翻译的错误) tRNAmetf CA3UA = GUG or AUG, 调控AARS准确识别tRNA和负载aa, 限制对UAG/UAA stop codon的通读, anti-codon两侧碱基的修饰,以提高配对的稳定性,codon/anti-codon 的稳定性,A,U多的 anti-codon, 其两侧多发生修饰, 发生修饰的碱基对摇摆配对的碱基存在结合力的 差异,导致了部分的codon bias,U* A G I U C A,5.3.3. tRNA abundance & codon usage (codon bias),中度重复基因tRNA的拷贝数与codon使用频率的对应,- 识别同
15、一氨基酸的不同tRNA(isoacceptor)量不等,- 不同生物间同一isoacceptor的量不等,tRNA abundance ; codon usage (codon bias) 是进化中 形成的基因表达调控机制之一,a) tRNA abundance 正相关 codon usege,b) 需要量多的蛋白质(除mRNA转录速率高外),需要量少的蛋白质(除mRNA转录速率低外),进化中形成的蛋白质翻译调控机制(modulator ),需较长时间 以求结合稳定,融解温度高 需较长时间,自然选择codon/anti-codon 间适度结合强度的codon usage 以保证最佳的蛋白质合成
16、速率,23 / 1209 10 / 1209 13 / 1209 3 / 1209,Phe (UUC) (UUU) Tyr (UAC) (UAU),Anti-codon AAG1 AUG1,In prok. Gly (GGG) usage = 0 Pro (CCC) usage = 0,共性: codon/anti-codon 间适度结合强度 个性: G/C含量不同, tRNA丰度各异,5.3.4. two of three codon-reading in mitochondrial,a) 线粒体中具有与通用密码不同的编码信息, 线粒体codon较为整齐(均为2/4/6),2 codon;
17、F, I, Y, H, Q, N, E, k, D,W, M, C 4 codon; V, P, T, A, R, G, (family) L, S (2 isoacceptors each), In mt 22 tRNA only (32 tRNA in universal code),线粒体“三中读二”方式可减少tRNA, Codon-reading,For codon family; two of three reading,codon UCU-UCA-UCG-UCC, Codon-reading,For 2 codon type; Nt34 wobble base G C/U, Cod
18、on-reading,For 2 codon type; Nt34 wobble base * U G/A, Codon-reading in mt, mt tRNA 与通用密码 tRNA 的结构差异,- no TC loop in mt-tRNA,-no DHU loop in some mt-tRNA,-G+C/A+U = 0.250.94 in mt-tRNA,G+C/A+U = 12 in universal tRNA 二级结构松弛,满足于 codon family的识读,5.3.5. codon in codon or general genetic codon (GGC 广义密码子
19、),生物体除具有标准的通用密码保证蛋白质的准确翻译外,同时存在GGC,a) codon / anti-codon间的缔合能分析, 2ed Nt of codon (N1N2N3) 对codon/anti-codon的缔合能贡献最大,凡2edNt相同的codon codon/anti-codon间的缔合能相似, 对缔合能的贡献 1thNt 3rdNt,b) codon对氨基酸性质的决定,2edNt of codon 对氨基酸性质和蛋白质空间结构 的决定度较大,NUN 非极性氨基酸 -helix &-sheet的形成者,NCN 非极性或中性氨基酸, 位于疏水区, 分子量较小 与- helix &-
20、sheet的形成无关,NPuN 编码的氨基酸往往位于蛋白质分子的表面,c) Nt of codon 对蛋白质功能的决定, 1th & 3rd Nt的摇摆 对蛋白质的结构与功能影响不大, 2edNt不能摇摆,2edNt of codon对氨基酸的编码特征 即为GGC or codon in codon,d) 生物学意义,依据codon in codon (2edNt of codon),蛋白质性质预测 蛋白质定点诱变 蛋白质改造,保证遗传的稳定,Codon in codon (依 2edNt of codon预测氨基酸的性质),2ed Nt = U ( hydrophobic aa ) A (
21、hydrophilic aa ) G/C ( neutral aa ),5.4. peptide synthesize,Protein synthesis occurs in three subcellular compartments each contain different machinery in plant,mRNA,细胞质,核孔,细胞质,细胞核,亮氨酸,天门冬氨酸,异亮氨酸,转运RNA,氨基酸,亮氨酸,天门冬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,细胞质,核糖体,肽键,亮氨酸,亮氨酸,肽键,亮氨酸,天门冬 氨酸,5.4.1 Direction of peptide elongation N C,
22、in Prok. f MettRNA metf,AminoacyltRNAaa,in Euk. MettRNA metI,非特异结合位点 DHU loop 特异结合位点 paracodan,5.4.2. peptide synthesize,a.Initiation Enzyme of translation in Prok.,IF-1 9.5kd 加强IF-2,IF-3的酶活 IF-2 95kd-117kd 促使fMet-tRNA fmet 选择性的结合 在30S亚基上 IF-3 20kd 促使30S亚基结合于mRNA起始 部位 具有解离30S与50S亚基的活性,c. Initiation
23、ribosome complex,including 8 activetion sites & occupy 20 Nt,P site (peptidyl attechment site) A site (Aminoacyl binding site),E site (Exit site of tRNA) 5s rRNA site (5s rRNA + TC loop),转位因子EF/G binding site mRNA binding site,peptididyl transferase binding site 延伸因子复合体EF-Tu-aa-tRNAaa binding site,d
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