宋存江《生物技术概论》2.基因工程---新.ppt
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1、2. 基因工程,学习目的 学习基因工程基本原理和基本操作过程,为进一步学习生物技术相关知识和从事基因工程工作打下基础。,2.1 基因工程概况 2.1.1基因工程的基本含义 按照人们的愿望(人为的),进行严密的设计(类似工程设计),通过体外DNA重组(非生命活动过程)和转基因等技术,有目的地改造生物种性,使现有的物种在较短的时间内趋于完善(区别于自然突变和常规育种),创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。,基因工程 2 基因工程,2.1.2 基因工程的主要理论依据 不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) 基因是可以从DNA上切割下来的 基因是可以转
2、移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的(绝少数除外) 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代,基因工程 2.1 基因工程概况,2.1.3 基因工程研究的基本技术路线,基因工程 2.1 基因工程概况,2.1.4 基因工程突出的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移,基因工程 2.1 基因工程概况,2.2.1 DNA 2.2.1.1 DNA的组成和结构,基因工程 2 基因工程,DNA由腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞
3、嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸组成。 脱氧核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸基组成。 四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和位置相同,只是各自的碱基不同。,2.2 DNA重组,碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4种。脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接。多个脱氧核苷酸按此方法连接成多聚脱氧核苷酸,其一端为游离的5-磷酸基(5P)称为5端;另其一端为游离的3 -羟基(3OH),称为3端。,基因工程 2.2.1.1 DNA的组成和结构,基因工程 2.2.1.1 DNA的组成和结构,DNA的双螺旋结构 DNA两条脱氧核苷酸链总是按照碱基A与T互补配对和G与C互补配对的,通过氢
4、键形成稳定的双螺旋结构,称为双链DNA。 少数病毒和噬菌体中的DNA是以单链形式存在的。,基因工程 2.2.1.1 DNA的组成和结构,B-DNA双螺旋分子模型,基因工程 2.2.1.1 DNA的组成和结构,2.2.1.2 DNA的功能 (1)DNA分子能在细胞内复制 以原有的DNA链为模板,从特定的复制起始位点 (ori)起始,复制出新的DNA链。 (2)DNA是基因的主要携带者 一个基因是DNA分子上的一个特定的核苷酸序列。,基因工程 2.2.1 DNA,基因工程 2.2.1.2 DNA的功能,原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列 Pribnow框或-10区: -4 -13bp之间由个核
5、苷酸组成,多数是TATAAT序列。 -35区:-35bp前后保守的TTGACA序列。,动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列,基因工程 2.2.1.2 DNA的功能,终止子发夹结构序列,基因工程 2.2.1.2 DNA的功能,2.2.2 获得DNA片段的主要途径 目的: (1)获得含有基因的DNA片段 (2)获得含有基因表达调控因子的DNA片段 (3)获得含有与基因重组有关的核苷酸序列的DNA片段 主要途径: (1)限制性内切核酸酶酶切法 (2)PCR扩增法 (3)化学合成法,基因工程 2.2 DNA重组,2.2.2.1 限制性内切核酸酶和DNA片段化 限制性内切核酸酶(restriction
6、 endonuclease) 功能:能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并在合适的反应条件下,使每条链的一个磷酸二酯键断开,产生具有3OH和5P的DNA片段。 命名:HindIII由Haemophilus influenzae Rd中属名的H,种名的in 和菌株代号的d组成, III表示从此菌株中提取的第三种限制性内切核酸酶。 识别序列规律:旋转对称或左右互补对称。 切割位点:在识别序列上使磷酸二酯键断开的位置。,基因工程 2.2.2 获得DNA片段的主要途径,限制性内切核酸酶识别序列、酶切位点和酶切片段末端,基因工程 2.2.2.1 限制性核酸内切酶和DNA片段化,粘性末端:产生的 DNA片段
7、末端的一条链多出一至几个核苷酸。3端比5端长的称为3粘性末端,5端比3端长的称为5粘性末端。 平末端:产生的DNA片段末端是平齐的。,限制性内切核酸酶的切割方法: 单酶切法 双酶切法 完全酶切法 部分酶切方法,环状DNA酶切片段示意图,基因工程 2.2.2.1 限制性核酸内切酶和DNA片段化,2.2.2.2特异性DNA片段的PCR扩增 特点:体外高效扩增特异DNA片段。一个待扩 增的DNA片段,在3h内可扩增出约106 个这样的DNA片段。 关键因子: 耐热性DNA聚合酶 引物,基因工程 2.2.2 获得DNA片段的主要途径,反应过程: 反应系统加热至9095, 底物双链DNA变性成为两条单链
8、DNA; 降温至3760,使引物与模板DNA链互补序列杂交 ( 复性 ); 升温至7075,耐热性DNA聚合酶催化引物按53方向延伸, 合成模板DNA链的互补链。 重复以上过程,一般经过2530次循环片段。,基因工程 2.2.2.2特异性DNA片段的PCR扩增,基因工程 2.2.2.2特异性DNA片段的PCR扩增,PCR反应五要素,引物(软件设计) Taq酶 (脱氧核糖核酸 polymerase) dNTP (dATP,dGTP,dCTP,dTTP) 模板 Mg2+,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,PCR扩增特异性DNA片段过程,after 25
9、cycles, amplification = 225 1 x 106 fold after 45 cycles, amplification = 245 3.5 x 1012 fold,(2)耐热性DNA聚合酶 在使靶DNA变性的高温下仍保持活性。 (3)PCR引物 引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补,并能引导模板DNA互补链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体,3端必须具备游离的-OH。 (4)DNA片段PCR扩增系统,2.2.2.3 化学合成目的基因 根据待合成的DNA片段预定的核苷酸序列,采用DNA合成仪,将4种核苷酸单体按35磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。,基因工程 2.2.2 获得DN
10、A片段的主要途径,DNA合成仪,2.2.3 DNA片段的连接 2.2.3.1 DNA连接酶(DNA ligase) 催化机理:催化双链DNA片段紧靠在一起的3OH末端与5 P末端之间形成磷酸二酯键,使两末端连接。 目前常用的连接酶: E.coli DNA 连接酶或T4 DNA 连接酶。,基因工程 2.2 DNA重组,具互补粘性末端片段之间的连接,基因工程 2.2.3 DNA片段的连接,2.2.3.2 DNA片段之间的连接,基因工程 2.2.3.2 DNA片段之间的连接,具平末端DNA片段之间的连接,基因工程 2.2.3.2 DNA片段之间的连接,DNA片段末端修饰后进行连接,DNA片段末端修饰
11、后进行连接,基因工程 2.2.3.2 DNA片段之间的连接,DNA片段脱磷酸化后连接,DNA片段末端修饰后进行连接,基因工程 2.2.3.2 DNA片段之间的连接,DNA片段加连杆后或加衔接头连接,基因工程 2.2.3.2 DNA片段之间的连接,2.2.3.3 DNA重组类型 插入重组 置换重组,基因工程 2.2.3 DNA片段的连接,3月21日,基因工程 2 基因工程,基因克隆载体的含义 能够承载外源基因,并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体(gene cloning vector)。,2.3 基因克隆载体,转基因研究中,单独一个基因或组成基因的某个元件,一般不易进
12、入受体细胞,也不易在受体细胞内稳定维持。,基因克隆载体应具备的基本条件,(1)含有允许外源DNA片段组入的多克隆位点。 (2)能携带外源基因进入受体细胞,或复制或整合。 (3)具有合适的筛选标记 根据转化子抗药性进行筛选的ampr, 根据转化子蓝白颜色进行筛选的lacZ, 表达产物gfp等 (4)克隆载体必须安全,不应含有对受体细胞有害基因,不会任意转入其他细胞。,利用-半乳糖苷酶插入失活的载体,在生色底物(X-gal)和诱导物(1PTG)存在时,可形成深蓝色菌斑。用这种载体进行克隆时,-半乳糖苷酶基因的大部分被外源DNA片段取代,所产生的重组体丧失-互补能力,在含有X-gal和IPTG的平板
13、下形成无色菌斑。因此,对于这类重组载体,可通过组织化学方法进行重组子的筛选。,蓝白斑筛选,克隆载体种类 按构建克隆载体的材料来源分: 质粒克隆载体、 病毒(噬菌体)克隆载体、 线粒体克隆载、 人工染色体克隆载体、 叶绿体克隆载体 按克隆载体的用途分: 一般克隆载体、表达载体、建库载体、T或U载体 ,基因工程 2.3 基因克隆载体,按克隆载体的受体生物分: 原核生物克隆载体 大肠杆菌克隆载体、 放线菌克隆载体 真核生物克隆载体 酵母克隆载体、 植物克隆载体、 动物克隆载体 、 人克隆载体 ,基因工程 2.3 基因克隆载体,克隆载体种类,含义: 以质粒DNA分子为基础构建的克隆载体,必须含有质粒的
14、复制起始位点。 种类: 大肠杆菌质粒载体 蓝藻穿梭质粒载体 农杆菌Ti质粒载体 酵母2m质粒载体 ,2.3.1 质粒克隆载体,基因工程 2.3 基因克隆载体,质粒DNA,质粒载体,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子; 质粒常见于原核细菌和真菌中,一般以cccDNA的形式存在;绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。,基因工程 2.3.1 质粒克隆载体,(1) 大肠杆菌质粒载体,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322:,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,pBR322简图,基因
15、工程 2.3.1 质粒克隆载体,选择标记基因(抗药性基因) 氨苄青霉素(Ap 或Amp) 氯霉素(Cm或Cmp) 卡那霉素(Kn 或Kan) 四环素(Tc或Tet) 链霉素(Sm 或Str),重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18 / 19:,拷贝数 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点(MCS),正选择颜色标记 lacZ,基因工程 2.3.1 质粒克隆载体,(2) 蓝藻和大肠杆菌穿梭质粒载体,人工构建,含有不止一个复制起点,能携带外源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。,(3) 农杆菌Ti质粒载体,基因工程 2.3.1 质粒克隆载体,(4) 酵母2m质粒
16、载体 存在于真核微生物酵母菌细胞核中但独立于染色体 内的长度为2m 并与组蛋白相结合的 DNA 质粒。,病毒(噬菌体)克隆载体,含义 以病毒(噬菌体)DNA或cDNA为主构建的克隆载体,或者通过转染直接进入宿主细胞,或者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。 种类 噬菌体克隆载体:噬菌体克隆载体 Cosmid载体 植物病毒克隆载体: CaMV克隆载体 动物病毒克隆载体: 痘苗病毒载体 腺病毒载体 反转录病毒克隆载体,2.3.2 病毒(噬菌体)克隆载体,基因工程 2.3 基因克隆载体,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性: 生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体
17、由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,I 噬菌体克隆载体,l 噬菌体生物学特性: 生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l - DNA,此末端称为cos位点,此末端称为cos位点,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体生物学特性: 感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬
18、菌体DNA,l 噬菌体生物学特性: 溶原状态,l噬菌体感染大肠杆菌后,除能裂解细胞外,也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上,并不产生子代噬菌体颗粒,这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活,而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质,使噬菌体或处于溶原状态,或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态。,噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建:缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,(5
19、1 26),载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,(36 26),基因工程 2.3.2 病毒(噬菌体)克隆载体,cosmid载体,cosmid载体是一类人工构建的含有,1978年Collins和Hohn发明构建,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,特殊类型的载体,cos site - carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,装载范围为30 - 45 kb,考斯质粒载体的特点:,能像l-DNA那样进行体外包装,并高效
20、转染受体细胞,装载量大(45 kb)且克隆片段具有一定的大小范围,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便,筛选容易,不能体内包装,不裂解受体细胞,cosmid载体,II 植物病毒克隆载体,烟草花叶病毒(TMV)克隆载体,III 动物病毒克隆载体,腺病毒克隆载体 腺病毒(adenovirus, Ad)是一类无囊膜的20面体病毒,含有一个线性双链DNA分子。Ad-DNA两端具有逆向末端重复序列IRT. 在每一条单链DNA的5端共价结合一种特殊结合蛋白(5.5kD)TP, 当DNA从病毒颗粒中释放后, 通过该蛋白连接成环状。,基因工程 2.3.2 病毒(噬菌体)克隆载体,2.3.3 人工染色
21、体载体大DNA片段克隆载体 (1)含义: 指能在宿主细胞中稳定地复制并准确 传递给子细胞的人工构建的染色体。 (2)特点:能容纳长达 1000kb以上的外源DNA片段。 (3)用途:构建基因组文库,克隆和转移完整的高分 子量基因,基因功能鉴定,基因治疗,基因工程 2.3 基因克隆载体,(4)类型: 线形的人工染色体:必须含有端粒、着丝粒和 复制起始区。 包含:酵母人工染色体(YAC) 人类人工染色体(HAC) 哺乳动物人工染色体(MAC) 环形的人工染色体:不需要端粒和着丝粒,但必须 含有合适的复制起始区。 包含:细菌人工染色体(BAC) 源于噬菌体1的人工染色体(PAC) 双元细菌人工染色体
22、(BIBAC) 可转化人工染色体(TAC),基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,人工染色体载体,细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosomes BAC),细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上,构建的,其装载量范围在50 - 300 kb之间,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝,pBACs主要适用于:,克隆大型基因簇(gene cluster)结构,构建动植物基因文库,基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,人工染色体载体,酵母人工染
23、色体(Yeast Artificial Chromosomes YAC),YAC载体应含有下列元件:,酵母染色体的端粒序列,酵母人造染色体的构建:,pYAC4,CEN4,EcoRI,URA3,TEL,BamHI,TEL,ori,Apr,TRP1,ARS1,酵母染色体的复制子,酵母染色体的中心粒序列,酵母系统的选择标记,大肠杆菌的复制子,大肠杆菌的选择标记,YAC载体的装载量为350 - 400 kb,人造染色体载体,酵母人造染色体(Yeast Artificial Chromosomes YAC),酵母人造染色体的使用:,EcoRI,EcoRI,EcoRI,BamHI,连接,转化酵母菌,重组酵
24、母染色体,基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,基因工程 2.3.3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,构 建 人 类 人 工 染 色 体 的 基 本 策 略,HAC,人工染色体的某些性质表,2.3.4体内同源重组整合载体(系统),原理:两个不同的DNA分子在同源序列处发生重组,将各自携带的处于同源序列内的遗传信息互相交换。 系统包括: 整合平台:受体细胞基因组上给定的一个DNA区域,是外源DNA的定位整合位置。 定为整合载体:除了一般质粒载体应有的元件外,还必须含有一或两个与整合平台DNA区域同源的DNA片段。,2.3.4.1 常规基因整合平台系统 内源平台双交换置换载
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