生物化学课件(第二部分:4-5章).ppt
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1、生物化学课件 (第二部分:4-5章),Protein,第章 蛋白质的共价结构,蛋白质 (Protein),1838年,J. J. Berzelius提出,由proteios衍生而来 第一重要,首要的物质,蛋白质存在于所有生物细胞中,是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础,参与了几乎所有的生命活动过程。,一、蛋白质通论,(一)、蛋白质的化学组成和分类,、元素组成,、蛋白质的含氮量,蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。 大多数蛋白质含氮量接近于16% 蛋白质含量 = 每克样品中含氮的克数6.25 凯氏定氮法,、蛋白质的分类,(1)、依据外形分类 球状蛋白质:glo
2、bular protein 纤维状蛋白质:fibrous protein 膜蛋白质:membrane protein,(2)、依据蛋白质的组成分类,简单蛋白 simple protein 单纯蛋白,仅由氨基酸组成 结合蛋白 conjugated protein,由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成,简 单 蛋 白,清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 广泛存在于动物组织 谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白,不溶于水,易溶于稀酸/碱 精蛋白和组蛋白 碱性蛋白存在于细胞核 硬蛋白,结 合 蛋 白,色蛋白:简单蛋白+色素物质 糖蛋白:简单蛋白+
3、糖类物质 脂蛋白:简单蛋白+脂类结合 核蛋白:简单蛋白+核酸,(二)、蛋白质的大小与分子量,蛋白质是分子量很大的生物分子 对任一种给定的蛋白质,其所有分子在AA组成和顺序以及肽链的长度方面都应是相同的,即所谓均一的蛋白质。,蛋白质与多肽无严格的界线 通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大,蛋白质月示胨多肽肽AA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500,(三)蛋白质构象和结构的组织层次,蛋白质的结构层次,一级结构,二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构,高级结构 空间构象,示 例,(四)、蛋白质功能的多样性,1. 催化功能-酶
4、 2. 调节功能-激素、基因调控因子 3. 转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白 4. 贮存功能-乳、蛋、谷蛋白 5. 运动功能-鞭毛、肌肉蛋白 6. 结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架 7. 支架作用-接头蛋白 8. 防御功能-免疫球蛋白 9. 异常功能,二、肽(peptide),AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键 称肽键,所形成的化合物称肽。,由两个AA组成的肽称为二肽。 由多个AA组成的肽则称为多肽。 组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。,多肽链中AA残基按一定顺序排列:氨基酸顺序 含游离-氨基的一端:氨基端或N-端 含游离-羧基的一端:羧基端或C-端 AA顺序是从N-端开
5、始以C-端氨基酸残基为终点 如上述五肽:Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,(一)、肽和肽键的结构,肽键中C-N键有部分 双键性质 不能自由旋转 组成肽键原子处于 同一平面(肽平面) 键长及键角一定 大多数情况以反式 结构存在,共价主链,(二)、肽的物理化学性质,肽末端-羧基pKa值比游离AA中的大。 肽末端-氨基pKa值比游离AA中的小。 等电点(两性)。 酸碱性质取决于: -羧基、-氨基、侧链基团的解离 具有双缩脲反应Pr特有的反应。,(三)、 天然存在的重要多肽,三、蛋白质一级结构的测定,什么是Pr的一级结构?,蛋白质中氨基酸的排列顺序。,1.样品必需纯(97%以上) 2.知道蛋白质
6、的分子量 3.知道蛋白质由几个亚基组成 4.测定蛋白质的AA组成并根据分子量 计算每种AA的个数 5.测定水解液中的氨量计算酰胺的含量,前提,(一)、蛋白质测序策略,(1) 测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系,即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,(一)、蛋白质测序策略,(2) 多肽链的拆分,蛋白质一级结构的测定,(一)、蛋白质测序策略,几条多肽链借助非共价键连接在一起,称为寡聚蛋白质,血红蛋白为四聚体,烯醇化酶为二聚体。 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理,即可分开多肽链(亚基)。,蛋白质一级结构的测定,(一)、蛋白质测序策
7、略,(3) 断开二硫键 在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下,用过量的-巯基乙醇处理,使二硫键还原为巯基,然后用烷基化试剂保护生成的巯基,防止重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,(一)、蛋白质测序策略,蛋白质一级结构的测定,(4)测定每条多肽链的AA组成,并计算出AA成分的分子比,(一)、蛋白质测序策略,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端 (6)多肽链断裂成多个肽段 采用两/多种不同的断裂方法将多肽 断裂成两套或多套肽段,并将其分离。,蛋白质一级结构的测定,(一)、蛋白质测序策略,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序,蛋白质一级结构的测定,(8)确定肽段在多肽链中的次序 利用两/多套肽段的
8、AA顺序彼此间的交错重叠,拼凑出整条多肽链的AA顺序。,(一)、蛋白质测序策略,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,两类多肽链末端氨基酸残基: N-端氨基酸 C-端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中,最重要的是N-端氨基酸分析法。,(二)、末端氨基酸残基测定,Sanger法,1、 末端分析, 二硝基氟苯(DNFB)法,O,2,N,F,N,O,2,+,H,2,N,C,H,C,R,O,H,N,C,H,C,R,O,O,2,N,N,O,2,H,+,H,2,O,O,2,N,N,O,2,H,N,C,H,C,R,O,O,H,+,氨基酸,DNFB,N-端氨基酸,DNP衍生物,DNP-氨基酸,
9、(二)、末端氨基酸残基的鉴定,N,碱性条件,二硝基苯衍生物,黄色,二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光,检测灵敏度高, 丹磺酰氯(DNS)法,(二)、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,1 N,(DNS-aa),苯异硫氰酸酯(PITC)法,(二)、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,1 N,pH8.3,无水HF,苯异硫氰酸酯PITC,肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解 根据不同反应时间测出释放的AA种类和数量, 按反应时间和AA残基释放量作动力学曲线 蛋白质N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。,氨肽酶法,(二)、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端
10、分析,1 N,肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质, 肼解法,(二)、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,2 C,(二)、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,2 C,C末端AA 氨基醇, 还原法,硼氢化锂,肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 根据不同反应时间释放出的AA种类和数量 蛋白质C-末端残基顺序。 四种羧肽酶:A,B,C和Y; A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母) A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键,羧肽酶法,(二)、末端氨基酸残基的鉴定,、 末端分析,2 C,(三)、二硫键的断裂,盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价
11、力。 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,1、酸水解,(四)、氨基酸组成的分析,2、碱水解,1、酶解法: 内切酶:胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶:羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,(五)、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化,R1=Lys(K)和Arg(R) 专一性较强,水解速度快 R2=Pro(抑制),肽链,水解位点,胰蛋白酶trypsin,R1=Phe(F)、 Trp(W)Tyr(Y)等疏水性AA Leu、Met和His稍慢 R2=Pro(抑制) pH8-9,肽链,水解位点,糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin),水解速度与相邻AA性
12、质有关: 酸性:-/碱性:+,R2=Phe(F)、 Trp(W)、 Tyr(Y)、Leu(L)、Ile(I)、Met(M)、Val(V)及其它疏水性强的AA水解速度较快,肽链,水解位点,R2= Pro或Gly,不水解 R1或R3=Pro,抑制水解,嗜热菌蛋白酶(thermolysin),R1和/或R2Phe(F)、Trp(W)、Tyr(Y)、 Leu(L)及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro(抑制) pH2,肽链,水解位点,胃蛋白酶Pepsin,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶,2、化学裂解法 溴化氰水解法(Cyanogen bromide) 选择性地切割由Met羧基形成的肽键。,(五)、
13、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化,多肽链的选择性降解,NH2OH断裂: 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂,3、肽段的分离纯化: 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法,N-端分析法 特点:能够不断重复循环,将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,1、 Edman法,(六)、肽段氨基酸序列的测定,(苯异硫氰酸酯法),Edman于1950年首先提出。,PITC,PTC-肽,2、氨肽酶法或羧肽酶法,3、质谱法(MS) 灵敏度高、所需样品少、测定速度快,核糖体,蛋白质链,4.根据核苷酸序列的推定法,(七)、肽段在多肽链中次序的决定,重叠肽(over
14、laping peptide),胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键,含有-S-S-的肽段带电性质发生变化,转向90二次电泳,曾含二硫键的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较,确定二硫键的位置,(八)、二硫键位置的确定,胃蛋白酶 最适pH约2,此时二硫键不断开 专一性低、肽段短,(九)、蛋白质测序举例,(十)蛋白质序列数据库 www.ncbi.nlm.org,同源蛋白质:来自不同生物体、 执行同一 /相似功能的蛋白质 同种蛋白质:来自相同生物体、 执行同一功能的蛋白质,1、同源蛋白质,四、蛋白质的AA序列与生物功能,(一)同源蛋白质的物种差异
15、与生物进化,一百多个AA残基 MW约12.5103 2 8个不变残基 细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。,2、细胞色素C与系统树,invariant residues (yellow) conservative substitutions (blue) nonconservative or variable residues (unshaded),Conservation and variation of cytochrome c sequences,1、氧合血红蛋白,(二)同源蛋白质具有共同的进化起源,该酶类活性中心的Ser残基起关键作用 胰蛋白酶
16、、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、 凝血酶和纤溶酶 有序列同源性 对底物偏爱不同,2、丝氨酸蛋白酶类,卵清中的溶菌酶(lysozyme) - 乳清蛋白(lactalbumin) 三级结构很相似 也可能具有共同的祖先。,3、一些功能差异很大的蛋白质,(三)血液凝固与AA序列的局部断裂,凝血酶原,血液凝固:在凝血因子的作用下,可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋白网。,可溶性的 血纤蛋白原,酶,有活性的凝血酶,不溶性的 血纤蛋白网,(一)肽的人工合成 保护(氨基、羧基、侧链活性基团) 活化(氨基、羧基) 缩合剂 (二)胰岛素的人工合成 (三)固相肽合成,五、肽与蛋白质的人工合成,Protein,第章
17、蛋白质的三维结构,蛋白质三维结构,二级结构,三级结构,四级结构,超二级结构和结构域,研究蛋白质结晶体: (一)X射线衍射法,一、 研究蛋白质构象的方法,The Nobel Prize in Physics 1901 “for their theories, developed independently, concerning the course of chemical reactions“,Wilhelm Conrad Roentgen Germany Munich University Munich, Germany 1845 - 1923,伦琴,1901年获 诺贝尔物理奖 W.C. (
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- 生物 化学课件 第二 部分
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