链霉素诱变育种的方案.ppt
《链霉素诱变育种的方案.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《链霉素诱变育种的方案.ppt(56页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、链霉菌诱变育种方案,11级生物技术班 第二组,元芳!此事你怎么看?,看目录,一、诱发突变 (一)、出发菌株选择 (二)、诱变剂及诱变剂量的选择 (三)、影响诱变效果的因素 (四)、平板分离 二、突变株的筛选 (一)、初筛 (二)、复筛 (三)、产物活性测定 三、营养缺陷型菌株的筛选 四、高产变株最佳环境条件的调整,插曲(很有必要),诱变育种的一般程序如下: 出发菌株-菌种纯化(出发菌株性能测定)-制备斜面孢子-制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)-诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)-平板分离(测定变异率)-挑取变异菌落并移植至斜面上-初筛(初筛数据分析,生产性状的粗测)-斜面传代-复筛(复
2、筛数据分析,精确测定生产性状)-变异菌株(菌株参数分析)-小型或中型投产试验-大型投产试验。,(一)、出发菌株的选择 选择从自然界(土壤)中分离链霉菌 放线菌是产生抗生素活性最大的一类微生物,迄今已在工业、医学、农业上都有利用抗生素成功的实例,而链霉菌又是放线菌中抗生素的主要产生菌,具有广泛的物种多样性和代谢多样性,是重要的资源微生物,但在链霉菌中普遍存在遗传不稳定性,而引起抗生素产量下降。,因此,我们要研究提高抗生素产量的方法,已期获得更大产量的抗生素,而提高产量的最重要途径是通过育种改变生产菌种。诱变育种是一种简便易行而且快速的选育方法,因而在抗生素的菌种筛选中应用最广泛。,一、诱发突变,
3、菌种的纯化:,1、土壤用无菌水浸泡,静置取上清 2、做梯度上清分别稀释10倍、100倍、1000倍等等 3、使用链霉菌优势培养基(在上边链霉菌比其他菌长的快),用步骤2的各个梯度液体分别铺板。 4、按照链霉菌最适生长温度培养。 5、选取菌落数在100个左右,菌落清晰无重叠的平板。 6、根据伯杰氏菌种鉴定手册中链霉菌的菌落外观介绍,粗选出基本符合的链霉菌。,7、挑取选出的菌落摇瓶培养,按照伯杰氏手册做理化指标检测。 8、符合伯杰氏手册上理化指标的,提总DNA,做16SrDNA扩增,测序 9、测序结果在NCBI上blast,最终确定菌种,链霉菌单孢子悬液的制备:,所处理的细胞必须是处于对数生长期同
4、步生长的细胞,并且是均匀状态的单细胞悬液,将121灭菌的无菌水加入到培养有链霉菌斜面的试管中,用接种环轻轻刮下孢子,(所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞,并且是均匀状态的单细胞悬液),将含有孢子的无菌水转入三角瓶中,加入玻璃珠,在摇床上打碎,经滤膜过滤后即得到单孢子率在98以上的单孢子悬液。,目的:在引起绝大多数细胞致死的同时,使存活个体中DNA的结构变异频率大幅度提高。,选择该出发菌株的原因如下:,对诱变剂的敏感性高; 具有特定生产性状的能力或潜力; 可采用划线分离法和稀释分离法进行纯化; 该菌株变异幅度广; 该菌株稳定性较好。,(二)、诱变剂的选择及诱变剂量的选择,选择物理诱变
5、剂中非电离辐射即紫外线。 因为紫外线是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变剂,大约有80%的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外线这一诱变方法。 紫外线的诱变育种 紫外线的作用机制是使两个嘧啶之间聚合,形成嘧啶二聚体,碱基不能正常配对。,紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯,波长为253.7nm,灯与处理物的距离为1530cm,照射时间依菌种而异,一般为几秒至几十分钟。,最适诱变剂量的选择,在诱变育种中有两条重要的实验曲线: 剂量-存活率曲线 剂量-诱变率曲线 通过比较以上两曲线,可找到剂量-存活率-诱变率三者的最佳结合点。在实际工作中,突变率往往随剂量的增加而提高,但到达一定程度后,再
6、提高剂量反而会使突变率降低。根据UV、X射线和乙烯亚胺,等诱变效应研究结果,发现正变较多地出现在偏低的剂量中,而负变较多地出现在偏高的剂量中。因此,在诱变工作中,大多倾向于采用较低剂量(致死率在70-80%)。,紫外线诱变的操作步骤:,1将细菌培养液以3000rmin离心5min,倾去上清液,加入无菌生理盐水洗涤再离心。 2将菌悬液放入巳灭菌的装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动,以打散菌体。将菌液通过滤纸过滤,单细胞滤液装入试管内,使细胞数约为108个ml,作为待处理菌悬液。 3取24ml制备的菌液加到直径7cm培养皿内,放入,一无菌磁力搅拌子,然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。在正式照
7、射前,应先开紫外灯预热10min,然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050s。操作均应在红灯下进行,或用黑纸包住,避免白炽光。,4取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离,计数活菌细胞数。 5取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液),120rmin振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。,(三)、影响诱变效果的因素,(1)菌种遗传特性 各菌株因遗传特性不同,对诱变剂敏感性也不一 样。 (2)菌体细胞壁结构 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗 入细胞。 (3)环境条件的影响 环境条件的影响包括: 诱变前预培养和诱变后培养
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 链霉素 诱变 育种 方案
链接地址:https://www.31doc.com/p-3088874.html