八章节基因工程.PPT
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1、第八章 基因工程,基因工程 ( genetic engineering)、基因克隆、DNA重组、 DNA克隆、分子克隆 克隆(clone) 无性繁殖 应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子(复制子、重组体),继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝,或其表达产物。,基因克隆示意图,基因工程大事记,1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因
2、家畜(兔、猪和羊),中国 转基因鱼,1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程,胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体,自然界的基因转移和重组,基因重组(genetic reco
3、mbination)整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译 自然界的基因转移和重组是无目的 基因工程有目的,结合作用 质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一个细胞(细菌) 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA,使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程,转导作用 transduction,病毒、噬菌体介导 溶菌途径;溶原菌途径,基因工程,工具酶 载体 重组DNA技术的基本过程 真核细胞转染 克隆基因的表达,工具酶,常用的工具酶:,一把特殊的剪刀 限制性内切酶的发现 阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和
4、内森斯(Nathans),获1978年诺贝尔生理学和医学奖,1953年,Arber研究噬菌体与细菌(A、B)的关系。 发现100-200个子代噬菌体中,只有1个可感染B,即其他的噬菌体在B中受到限制,唯有这一个受到修饰(甲基化)后感染成功。 细菌B:在缺甲硫氨酸的培养基中,细菌死亡。 原因:细菌无法对自己的DNA进行修饰。 假设:限制性内切酶与修饰酶。,1967年,Smith,分析限制性内切酶的识别和切割序列,认为它由5-6个碱基组成 原因:限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列:中心对称的回文结构。 限制性酶:Hind Nathans:用限制性酶切割猴子SV4
5、0DNA,DNA测序。,限制性核酸内切酶(restriction enzyme),识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类:型、型、型 命名: EcoR(E:属名;co:种名;R:株;:发现次序),识别和切割位点 回文结构 46 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 同工异源酶:来源不同,但能识别和切割同一位点 同尾酶:识别序列不同,但产生相同的粘性末端,粘性末端与平头末端,修饰酶,DNA聚合酶 逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(te
6、rminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) Taq DNA聚合酶,DNA聚合酶(pol )的活性,5至3的聚合活性 5 3方向 核酸 外切酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性 pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 大片段 (Klenow片段):聚合活性、 3 5外切活性 常用的工具酶,核酸外切酶活性,35外切酶活性 53外切酶活性,末端脱氧核苷酰转移酶(TDT),载体 vector,DNA ,能在宿主细胞中进行自我复制和表达 克隆载体、表达载体 原核载体:质粒(pBR322,pUC) 噬菌体(,M13)等 真核载体:动物病毒载体pLXSN等
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