第34章DNA和修复.ppt
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1、1,第34章 DNA的复制和修复,3,分子生物学的中心法则(central dogma) DNA RNA 蛋白质,复制,转录,翻译,逆转录,RNA复制,4,一、DNA复制 (一)半保留复制(semiconservative replication),模板 原则 特点,亲代DNA双链,每股链都可作为模板 按碱基配对原则指导新链合成 合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样 一条链来自于亲代的DNA链,另一条链是新合成的链,5,亲代DNA,子代,子代,半保留复制,新链,6,Old strand,New strand,The hypothesis of semiconservative r
2、eplication proposed by Watson and Crick in 1953.,Radioisotope labeling and density gradient centrifugation clearly distinguishes replications of semiconservative from conservative. (1958),8,9,10,11,A electron micrograph of the replication intermediate of a plasmid DNA: -shaped structures were observ
3、ed; no single stranded DNA is visible.,No complete unwinding of the two parental strands occurred before the daughter strands are synthesized,12,(二)半不连续复制 (semidiscontinuous replication) 1、 体内仅存在5 3的DNA聚合酶 2、 前导链与随从链(岗崎片段),13,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,半不连续复制,14,前导链(leading strand): DNA复制时
4、,一股以3 5方向的母链作为模板,新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。 (复制方向与解链方向一致),15,随从链(lagging strand): DNA复制时,一股以5 3方向的母链作为模板,新合成链沿5 3合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为随从链。 (复制方向与解链方向相反),岗崎片段(Okazaki),岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链,16,DNA半不连续复制: 3 5方向母链为模板,新链5 3方向连续合成5 3方向母链为模板,新链5 3方向合成许多不连续的片段(岗崎片段) 这种复制方式称之为半不连续复制。,17,(三)RNA引物,DNA聚合酶 不能催化两
5、个游离dNTP在DNA模板上聚合 需要具3-OH的引物 引物最后被DNA聚合酶除去、补满,再由连接酶连接,RNA聚合酶 能催化两个游离NTP在DNA模板上聚合,减少突变,提高DNA复制的真实性,18,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,RNA引物,3-OH,19,严格的碱基配对规律 RNA引物 聚合酶的选择作用 复制时有即时的校读功能 3 5外切酶功能 DNA损伤的修复机制,(四)复制的真实性,20,(五)参与DNA复制的酶类和蛋白质,dNTP Mg+ 3-OH引物 DNA模板 酶和蛋白质因子,DNA链合成的条件:,21,DNA聚合酶/ 解旋酶 单链结合蛋白(SSB) 拓
6、扑异构酶/ 引发体 DNA连接酶,酶和蛋白质因子,22,23,24,1、DNA的聚合反应,25,26,2、大肠杆菌DNA聚合酶(原核生物),3,5-磷酸二酯键,3,5,图12-4,包括5种DNA聚合酶: pol、,27,DNA聚合酶 多功能酶 5 3外切酶 3 5外切酶 5 3聚合酶 单链多肽(Zn2+) 大小二个片段 切除RNA引物 填补空缺 损伤后修复,DNA聚合酶 多功能酶 5 3聚合酶 3 5外切酶 不对称二聚体 单体1-前导链/单体2-随从链 DNA复制的主要酶 高续进性 高聚合酶活性 高产物真实性,28,29,3 5 5 3 外切酶 聚合酶,N,C,5 3 外切酶,小片段 35KD
7、,大片段( klenow片段) 68KD,切除RNA引物 损伤修复,校读功能,(常用的工具酶),(1)、DNA聚合酶(DNA Polymerase) Kornberg酶、DNA指导的DNA聚合酶 (DNA-Directed DNA Polymerase, DDDP),聚合功能,30,Large(Klenow)fragment of DNA pol ,31,32,33,DNA pol 合成速度太慢 持续合成能力低 影响DNA复制的基因突变与DNA pol 无关,仅参与局部修复,不是真正的复制酶,(2)、DNA聚合酶全酶 (DNA Polymerase holoenzyme),10种亚基组成,含锌
8、 2 (4个) DNA聚合酶全酶,核心聚合酶 连接两个核心聚合酶 夹钳装置复合体 星环状,容纳DNA双链,Sliding clamp subunits,聚合酶活性,聚合酶活性,3 5 外切活性, 复合物, 促进亚基结合于DNA,DNA pol III (复制酶),无5-3 外切酶活性 组成核心酶,促进核心酶 形成二聚体,组装,2 ,36,37,38,真核细胞的DNA聚合酶,五种 DNA 聚合酶 DNA聚合酶和PCNA DNA聚合酶 DNA聚合酶、,引物的合成 前导链、随从链合成 参与线粒体DNA的合成 参与DNA的修复,增殖细胞核抗原( 类似于亚基),39,(3)、DNA聚合酶、,DNA聚合酶
9、 5 3聚合酶活性 3 5外切酶活性 DNA聚合酶和(1999年以后发现) DNA受严重损伤时诱导产生 跨越受损部位 使复制缺乏准确性,(修复酶),40,3、DNA解旋酶及SSB,DNA解旋酶(helicase) 单链结合蛋白 (SSB),解开DNA双链 每对碱基消耗2个ATP 维持单链状态 使其不受核酸酶水解 避免单链DNA自身发夹螺旋形成 使前端螺旋易解开,大肠杆菌SSB与DNA结合具有协同效应,41,4、DNA拓扑异构酶,Linking number,两条链的互绕数,42,43,44,45,47,48,49,50,含拓扑异构酶(及H1) 与DNA复制及转录有关,51,拓扑异构酶/ (to
10、poisomerase) 拓扑异构酶/ 旋转酶 (gyrase),切断DNA双螺旋中一股,张力下降后封闭 消除负超螺旋 不需能量 切断DNA双链 引入负超螺旋 需ATP供能,(1)、大肠杆菌的拓扑异构酶,52,磷酸二酯键的转移,53,54,55,56,拓扑异构酶 拓扑异构酶 类型 :切断DNA双螺 旋中一股;不需能量 拓扑异构酶/,消除正/负超螺旋 消除负超螺旋 消除正/负超螺旋 不能导入负超螺旋,(2)、真核细胞的拓扑异构酶,57,5、引物酶和引发体,DNA聚合酶只能在模板链的指令下,在引物(通常RNA)3-OH添加新核苷酸功能,没有从头合成活力; 引物酶合成一小段RNA,作为DNA合成的引
11、物; 必须与几种辅助蛋白组装成引发体,才有合成引物的活性。 如:DnaA、DnaB、DnaC、DonaT、PriA、PriB、PriC等,59,6、DNA连接酶,催化二段DNA链之间3,5 磷酸二酯键的形成,3 OH,5,5,3,O O- P O O-,有缺口的DNA链,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,O O P O O-,5,3,缺口封闭,60,哺乳动物:ATP供能, 大肠杆菌:NAD供能, 都需要Mg2+,61,62,63,缺口填补: 连接双股DNA分子中一链的切口 双链DNA分子中双链的切口 不能连接二分子单链DNA,64,(1)岗崎片段之间的连接 (2)DNA损伤修复中的连接 (
12、3)一种重要的工具酶: 限制性内切酶切割后形成的粘性末端 或平头末端的连接,应用:,65,66,(三)DNA复制的过程(起始、延伸、终止),确定复制的起始点 解开双链DNA,提供单链DNA模板 形成复制叉 DNA合成的起始和延长 形成带有新合成的DNA片段的复制泡 复制的终止,67,原核生物 双向复制 (型复制) 特定起始点:oriC,真核生物 多个复制单位(复制泡) (复制起始点+复制叉) 多个起始点,1、复制的起始,68,大肠杆菌复制起始点oriC的结构,(1)9个核苷酸的重复序列4个,(2)13个核苷酸的重复序列3个,69,形成起始复合物,类组蛋白,70,DNA的甲基化与复制的发动有关,
13、Oric中含11个GATC Dam甲基化酶使A上N6甲基化(亲代) 半甲基化的Oric可与细胞膜结合,71,原核生物双向复制(型复制),72,真核生物复制泡(复制起始点+复制叉),74,DNA双链复制起始点,dnaA,dnaB/dnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物/3-OH,DNA聚合酶,dNTP,和3-OH形成3,5磷酸二酯键,解旋酶,SSB,SSB,3,3,5,5,引发体,解旋酶,拓扑异构酶,75,(1).DNA聚合酶的作用 (2).前导链合成1000-2000个核苷酸后, (3).随从链开始合成,岗崎片段的长度 为1000-2000个(大肠杆菌) (4).Po
14、l为不对称二聚体: 一个作用于前导链 另一个作用于随从链(loop),2、复制的延伸,后滞链中引物不断被合成,3,85,3、复制的终止,去除RNA引物 补充空缺 连接,DNA聚合酶的小片段 5 3外切酶 DNA聚合酶的大片段 3 5外切酶 5 3聚合酶 DNA连接酶,86,3,5,5,3,89,(七)真核细胞端粒DNA的复制,真核生物的线性染色体DNA 每复制一次,子链5有缺失 末端有特殊序列-端粒 特征: 由数百个串联重复的6核苷酸组成 人:5-AGGGTTAGGGTT-3 端粒能稳定染色体,1.端粒(telomere),90,二十世纪三十年代,遗传学家Barbava McClintock和
15、Hermann J.Muller发现,染色体的末端有一种能稳定染色体结构和功能的特殊成分。 如缺少染色体间会互相粘连、出现结构变化或其它错误行为,以致影响染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。,“端粒” (telomere),希腊语末端“telos”和部分“meros” 端粒 telomere,端粒帽 染色体 端粒帽,1978年首次发现四膜虫端粒的分子组成:,端粒 染色体DNA 端粒,人端粒的分子组成:,93,线形DNA复制末端问题,3,5,5,3,RNA引物水解,端粒 染色体DNA 端粒,95,组成 蛋白质(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板) 唯一携带RNA模板的逆转录
16、酶 人端粒酶: 模板(RNA-端粒酶):3-CAAUCCCAAUC-5 合成(DNA): 5-AGGGTT-3 端粒酶和衰老、肿瘤有关,2.端粒酶(telomerase),3、端粒酶的作用机制,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,2.聚合,1. 结合,3.移位,爬行模式,端粒酶的功能,TTGGGG,TTGGGG,末端补齐机制:,5,GGGGTT,(GGGGTT)n,端粒酶,5,3,5,DNA聚合酶,99,100,101,以延长的DNA单链为模板, 3-OH为引物合成富含C的 互补链,端粒帽 染色体DNA
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- 34 DNA 修复
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