第十章6.ppt
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1、第 三 篇 基因信息的传递,The Department of Biochemistry and Molecular Biology, CMU,中心法则(the central dogma),1958年,F.Crick最早提出。 1970年,H.Temin补充了逆转录现象。,第 十 章 DNA的生物合成(复制),DNA Biosynthesis (Replication),DNA的生物合成,复制(replication),是指遗传物质的传代,以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,第一节 复制的基本规律,Basic Rules of DNA Replication,DNA复制的特征,半保留性
2、(semi-conservative) 方向性 双向性 半不连续性(semi-discontinuous) 高保真性(highly fidelity),一、半保留复制,DNA生物合成时,母链DNA解开为两股单链,各自作为模板(template)按碱基配对规律,合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA,一股单链从亲代完整地接受过来,另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A
3、C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,全保留式 半保留式 混合式,DNA复制的几种可能方式,半保留复制的实验依据和意义,Meselson-Stahl的密度梯度实验 Matthew Messelson & Fra
4、nklin Stahl 于1958年所作的实验,证明了DNA复制的半保留性质。,半保留复制的意义,按半保留复制方式,子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致,即子代保留了亲代的全部遗传信息,体现了遗传的保守性。 遗传的保守性,是物种稳定性的分子基础,但不是绝对的。,二、 53方向性,DNA聚合酶只能催化3 5磷酸二酯键的生成,既5-P与3-OH生成磷酸二酯键,因此DNA新链的生成只能沿53方向进行。,三、双向复制,复制时,DNA从起始点向两个方向解链,形成两个延伸方向相反的复制叉,称为双向复制。,复制叉(replication fork),复制叉,复制时双链打开,分开成两股,新链沿着张开的模板生成
5、,复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉。,复制子(replicon),复制子是从一个DNA复制起始点起始的DNA复制区域,独立完成复制的功能单位。,习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。,原核生物,基因组是环状DNA; 只有一个复制起始点; 原核生物是单复制子完成复制,也称为复制体。,真核生物,真核生物是线形DNA; 真核生物每个染色体有多个起始点; 是多复制子(multireplicon)的复制。,四、复制的半不连续性,顺着解链方向生成的子链,复制是连续进行的,这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反,不能顺着解链方向连续延长,这股不连续复制
6、的链称为随从链。 领头链连续复制而随从链不连续复制,就是复制的半不连续性。,冈崎片段(Okazaki fragment),1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术,观察到DNA复制中出现一些不连续的片段,将这些不连续的片段称为冈崎片段。 原核生物: 10002000个核苷酸 真核生物: 100200个核苷酸,五、高保真性,DNA复制的精确度极高,在细菌中其误差只有10-810-10左右。,第二节 DNA复制的酶学,Zymology of DNA Replication,一、DNA聚合酶,全称是依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase),简称DN
7、A-pol。,Arthur Kornberg,罗杰科恩伯格与父亲,(一)原核生物的DNA聚合酶,1、DNA聚合酶I (DNA-pol I),第一个被发现,当时称为复制酶(replicase); 单肽链; 含量最多。 活性: 1. 53聚合酶活性; 2. 53核酸外切酶活性; 3. 35核酸外切酶活性。,?,5 3外切酶活性,能切除引物。,核酸外切酶活性,DNA-pol 的3 5核酸外切酶活性,A:DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基;并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B:碱基配对正确, DNA-pol不表现活性。,即时校读,3 5外切酶活性和5 3聚合酶活性协调作用,完成了DNA-pol
8、的即时校读功能。,Klenow片段,小片段具有5 3外切酶活性。 大片段又称Klenow片段,具有5 3聚合酶活性和3 5 核酸外切酶活性,是实验室合成DNA、进行分子生物学研究常用的工具酶。,2、DNA-pol ,具有53的聚合酶活性; 只是在无pol-及pol-的情况下暂时起作用; 对模板的特异性不高, 参与DNA损伤的应急状态修复(SOS修复)。,3、DNA-pol ,DNA pol III 的聚合酶活性远强于DNA pol I,因此是DNA复制的主要聚合酶。它是由10种亚基组成的不对称异源二聚体 。,DNA聚合酶全酶结构,2个核心酶(、) 1个-复合物(、 6种亚基) 可滑动的DNA夹
9、子(含1对-亚基),、亚基组成核心酶,亚基具有53聚合活性; “错配”实验可证实,DNA-pol 的亚基具有碱基选择功能; 亚基具有35外切酶活性 (校正功能); 亚基可能起组装作用。,嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型,与相应的嘧啶形成氢键配对,嘌呤应处于反式构型。 DNA-pol 通过对不同碱基构型亲和力的不同来实现其选择作用。,DNA聚合酶(核心酶)的三维结构 类似于半闭合的右手,在DNA-pol催化DNA聚合反应的过程中,先要形成正确互补配对的氢键(非共价),然后才能形成35磷酸二酯键(共价键)。,两边的亚基(DNA夹子)起着夹稳模板链,负责酶沿DNA模板滑动的作用。 其余亚基统称为-
10、复合物, 是DNA夹子加载蛋白,负责将DNA夹子加载于DNA,使DNA聚合酶具有持续合成能力。,pol III各亚基功能,催化DNA聚合,参与DNA损伤的应急状态修复,修复合成、切除引物、填补空隙,功能,-,-,+,5 外切酶活性,+,+,+, 5外切酶活性,+,+,+,5 聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,原核生物DNA聚合酶活性及功能,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,1. 遵守严格的碱基配对规律; 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能; 3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能。,(二)真核生物的DNA聚合酶,DNA聚合酶催化反应的特点,以单链DNA为模板
11、 以dNTP为原料 引物提供3-OH 聚合方向(新链的延长)只能为53 遵守碱基互补规律,二、引物酶(primase),DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP的聚合,而只能催化dNTP与已经存在的3-OH的聚合,这个3-OH通常是由一小段RNA提供的,称为引物(primer),催化此反应的酶称为引物酶。,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,复制的化学反应,聚合反应机理,引物酶,依赖DNA的RNA聚合酶; 对利福平不敏感; 可以催化游离NTP聚合,生成RNA引物; 在大肠杆菌,是dnaG 基因的表达产物,又称DnaG蛋白。 引物:为DNA聚合提供3-OH末端。,三、复制中
12、的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部,只有把DNA解成单链,它才能起模板作用。 此过程需要: 解螺旋酶(helicase) 单链DNA结合蛋白(SSB) DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),(一)解螺旋酶,又称rep蛋白或DnaB; 作用是利用ATP供能,解开DNA双链; 解螺旋酶在DnaA、DnaC蛋白的协助下,共同完成复制起始过程中解开DNA双链的工作。,(二)SSB,曾被称为螺旋反稳定蛋白(HDP),为由177个氨基酸残基组成的同源四聚体; 与DNA单链紧密结合,跨度约32个核苷酸单位; 是不断地结合、脱离的; 有正协同效应 。 SSB的
13、作用:维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,(三)DNA拓扑异构酶,拓扑:是指物体或图像作弹性移位而保持物体不变的性质。 拓扑酶:改变DNA拓扑构象,理顺DNA链。,解链过程中打结现象的出现,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶 I (topo I),曾用名:-蛋白 主要作用:切开DNA双链中的一股,使DNA解链旋转中不打结,在适当时候又把切口封闭,使DNA变为松弛状态。催化反应不需ATP,拓扑异构酶 II (topo II),又称旋转酶(gyrase); 无ATP时,能切断DNA双链,使螺旋松弛; 在利用ATP供能下,连接断端,松弛
14、的DNA进入负超螺旋状态。,四、DNA连接酶(DNA ligase),连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端,使二者生成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。催化作用需要 ATP/NAD+。 注:只能连接碱基互补基础上的双链中的单链切口,没有连接单独存在DNA单链或RNA单链的作用。,功能,DNA连接酶在复制中起最后接合双链中单链缺口的作用; 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用; 也是基因工程的重要工具酶之一。,三种酶催化生成磷酸二酯键的比较,DNA复制过程中所需的酶和蛋白因子,DNA聚合酶; 引物酶; 解螺旋酶; SSB; DNA拓扑异构酶; DNA连接酶
15、; 其它蛋白因子(DnaA、DnaC等)。,第三节 原核生物DNA复制的过程,DNA Replication Process in Prokaryotes,一、复制的体系,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶,简写为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端,使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子:拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶等,二、DNA复制的起始,复制的起始主要解决3个问题: 1.辨认复制起
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