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1、,双水相体系是怎样形成的? 其分配机理是什么? 什么双水相萃取? 双水相体系的相图? 双水相萃取的原理是什么? 特点是什么? 影响双水相萃取体系的因 素有哪些? 其应用范围是什么?,2.3 双水相萃取,2.3.1双水相体系的形 成与分配 2.3.2双水相萃取分离的原理 2.3.3双水相萃取体系的影响因素 2.3.4双水相萃取操作及特点 2.3.5双水相萃取的应用,掌握: 了解: 重点: 难点:,本节要点及学习要求,双水相体系的形成与分配机理 双水相萃取分离的原理 双水相体系中的分配平衡:静电作用、疏水作用。,聚合物的不相溶性、系线、双节线、临界点。 影响物质分配平衡的因素: 双水相中聚合物组成
2、的影响; 双水相系统物理化学性质的影响; 盐和缓冲液的影响;温度的影响。 双水相系统的应用。,双水相体系的形成与分配机理, 双水相萃取分离的原理和特点。,双水相体系的形成与分配机理。,(1)概述: 基因工程产品如蛋白质和酶的特点: 传统的溶剂萃取法并不适合。反胶束的办法可克服这些问题,但存在大量使用有机相和相的分离问题。 基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。,2.3.1 双水相体系的形成与分配,活性和功能对pH值、温度和离子强度等特别敏感; 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性。,技术诞生 1896年Bei jerinck观察到 先得到一浑浊不透明
3、溶液,随后分为两相, 水相也可以分为两相,即双水相系统 ? 将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一个水相中_双水相萃取. 开始于本世纪70年代,现已应用到酶、核酸、生长激素、病毒等分离提纯。近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。,明胶-琼脂水溶液混合 明胶-淀粉水溶液混合,2.3.1 双水相体系的形成与分配,(2)双水相体系,双水相,在一定浓度范围,密度不同两相,两相均含有 较多的水,明胶-琼脂水溶液混合 明胶-淀粉水溶液混合 葡聚糖-甲基纤维素,水溶液,2.3.1 双水相体系的形成与分配,向水相中加入高分子化合物PEG/葡聚糖或盐,在一定组成范围内,可以形成密度不同的
4、两相。 轻相富含高分子化合物PEG, 重相富含盐或高分子化合物Dx葡聚糖。,举 例,2.3.1 双水相体系的形成与分配,葡聚糖-甲基纤维素钠两相体系,2.3.1 双水相体系的形成与分配,0.39% 葡聚糖 0.65% 甲基纤维素钠 98.96% 水,1.58% 葡聚糖 0.15% 甲基纤维素钠 98.27% 水,几种典型的双水相系统,2.3.1 双水相体系的形成与分配,各 种 双 水 相 体 系,2.3.1 双水相体系的形成与分配,(3)双水相体系的类型,表面活性剂-表面活性剂,亲和配基-高聚物, 亲和双水相萃取,2.3.1 双水相体系的形成与分配,比 较,2.3.1 双水相体系的形成与分配,
5、4. 聚合物双水相形成机理,2.3.1 双水相体系的形成与分配,(5)双水相萃取分离的原理,生物分子在双水相体系中的选择性分配 分配规律服从能特特分配定律. 与溶剂萃取比,表现出更大或更小的分配系数.相图,2.3.1 双水相体系的形成与分配,2.3.1 双水相体系的形成与分配,2.3.1 双水相体系的形成与分配,M点, 两相T和B的量之间的关系(体积)服从杠杆规则,即,系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大,反之则越小。当系线长度趋向于零时,即在图b的双节线上K点,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1,因此K点称为临界点(critical point)。
6、,2.3.1 双水相体系的形成与分配,2.3.2.1 双水相分配系数 分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用。 包括:静电作用 疏水作用 生物亲和作用。 分配系数是各种相互作用力的和。 lnm=lnme+lnmh+lnml,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,2.3.2.2 影响分配系数的因素分析 1)成相聚合物 -相对分子质量和浓度影响分配平衡. 对于成相聚合物系统和生物大分子来说:,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,2)盐的种类和浓度 -主要影响相间电位和蛋白质疏水性。,影响带电蛋白质、核酸生 物大分 子的分配系数,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,影响蛋白质的表面疏水性, 改
7、变各相成相物质组成和相体积比. 分配系数随盐浓度增加而增加,不同蛋白质增加不同.,盐浓度,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,3)pH值,4)温度 温度影响相图, 规模化操作采用常温, 一般双水相系统来说,温度的影响很小。,蛋白质的表面电荷数,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,温度的影响,温度影响双水相系统的相图,因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说,当双水相系统离双节线足够远时,温度的影响很小,1-2度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。 大规模双水相萃取操作一般在室温下进行,不需冷却。这是基于以下原因: (1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用,常温下
8、蛋白质一般不会发生失活或变性; (2)常温下溶液粘度较低,容易相分离; (3)常温操作节省冷却费用。,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,6)双水相体系物理化学性质的影响:,双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数: 密度()和两相间的密度差 黏度()和两相间的黏度差以及表面张力() 相间电势差,相分离时间等。,5)低分子量化合物:高浓度时起作用。,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系,在临界点附近系线的长度趋向于零,上相和下相的组成相同,因此,分配系数应该是1。,界面张力增加系线的长度增加,上相和下相相对组成的差别就增大,这将会极大地影响产
9、物如酶分配系数,使酶富集于上相。,2.3.2双水相萃取体系的影响因素,2.3.3.1 双水相系统的选择 选择原则: 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质上的差别 综合利用静电作用、疏水作用,添加适当种类和浓度的盐,可选择性萃取目标产物。,2.3.3 双水相萃取操作及特点,目标产物与杂蛋白的等电点不同, 调节系统pH值,添加适当盐,产生希望的相间电位。 目标产物与杂蛋白的疏水性不同充分利用盐析作用 增大成相系统浓度使细胞碎片选择性分配于下相。 采用相对分子质量较大的PEG 降低蛋白质的分配系数,提高目标蛋白的选择性。,方 法,2.3.3 双水相萃取操作及特点
10、,2.3.3.2 双水相萃取过程 包括: 双水相的形成 溶质在双水相中的分配 双水相的分离。,2.3.3 双水相萃取操作及特点,萃取一般操作,蛋白质在两相中发生物质传递,达到分配平衡; 采用离心沉降进行相分离。,2.3.3 双水相萃取操作及特点,图5-19 聚已二醇(PEG)-磷酸盐双水相体系萃取酶的一般流程,2.3.3 双水相萃取操作及特点,两步萃取法连续分离胞内酶的流程图,2.3.3 双水相萃取操作及特点,2.3.3.3 双水相萃取的特点: 相混合能耗低, 达到萃取平衡所需的时间短 易进行工业放大(10ml离心管的实验结果即可放大) 适于易失活的蛋白质的提取纯化(超滤或沉淀) 易实现连续操
11、作最大特点,2.3.3 双水相萃取操作及特点,可用于多种生物活性物质的分离纯化 1)酶的提取和纯化 酶主要分配在上相,菌体在下相或界面处.,2.3.4 双水相萃取的应用,表5-7双水相萃取体系从微生物的破碎细胞中提取分离酶的实例,p84,2.3.4 双水相萃取的应用,2)核酸分离纯化 用PEG/Dextran体系萃取核酸时,盐组分的微小变化将会引起分配系数的微小变化。 3)人生长激素的提取 用PEG4000 6.6%/磷酸盐14体系从E.coli 碎片中提取人生长激素(hGH) (hGH)分配在上相,分配系数6.4,收率60.,2.3.4 双水相萃取的应用,2.3.4 双水相萃取的应用,4)干扰素( -IFN)的提取 不用PEG/Dextran体系 用PEG磷酸酯/盐的体系才能使-IFN分配在上相,杂蛋白分配在下相。,2.3.4 双水相萃取的应用,5)病毒的分离纯化 6)生物活性物质的分析检测 7)在中草药有效成分分离中的应用p85,2.3.4 双水相萃取的应用,双水相体系形成、类型及机理,双水相萃取的应用,总结,2.3.4 双水相萃取的应用,
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