荧光定量PCR原理应用及StratageneMx3000P介绍.ppt
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1、实时荧光定量PCR原理及应用,上海吉泰生物科技有限公司,裴杰萍,内 容 提 纲,荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪,常规核酸定量方法,Southern 杂交 Northern 杂交 原位杂交 传统 RT-PCR 半定量 PCR,存在的问题 灵敏度 准确性 特异性 时间,实时荧光定量PCR,定义 利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控 目的 对起始模板进行定量 优点 灵敏, 重复性, 动态范围宽, 高通量 原理 C(t)值与起始模板浓度的对数成反比,什么是C(t)值,C(t),Threshold(域值),C(t)值与起始模板的关系,为什么要引入C(
2、t)值,96 replicates of B7 gene molecular beacon,利用电泳定量,11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold difference,实时荧光定量,Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct shift) = 16 fold difference,如何定量,标 准 曲 线,未 知 样 品 的 C(t) 值,定量,常用的荧光试剂,SYBR Green ITM TaqMan / TaqMan-MGB Molecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux primers ScorpionsTM
3、 Amplifluor Q-Zyme Others.,dsDNA Detection,Target-specific Detection,ssDNA = free dye (weak fluorophore),dsDNA = Binds minor groove (intense fluorophore),SYBR Green I (双链DNA结合染料),SYBR Green I Detection,TaqMan 探针,未结合的探针,探针、引物与目的片段结合,FRET,光发射或者以热量形式散失,Donor dye (Reporter),Acceptor dye (Quencher),Light
4、,Energy transfer,Taq,Taqman 三通道实验,Daniel Candotti - Cambridge, UK,荧光定量PCR应用,特异核酸(基因)定性、定量 RNA (cDNA) 基因表达差异分析 基因芯片结果验证 DNA 病原体定性与定量 GMO (遗传改良组织)检测 序列特异性 等位基因分型, SNP 检测,应用之一:病原体检测与定量,绝对定量(特异基因的拷贝数病原体的多少) 标准品(如质粒):梯度稀释 未知样品 阴性对照(NTC),应用之一:病原体检测与定量,1,4,3,2,应用之一:病原体检测与定量,应用之二:基因表达差异分析,相对定量:基因表达量上升或者表达被抑
5、止的倍数 两种样品:Calibrator(对照,如正常组织) 与Sample(待测样品) 两个基因:目的基因与看家基因,应用之二:基因表达差异分析,Calibrator,Gene of Interest 目的基因, Ct1,应用之二:基因表达差异分析,基因表达差异2 /2, Ct1, Ct2,2, Ct1 - Ct2,XnX0(1+E),n,应用之二:基因表达差异分析,RNA抽提,RT,定量PCR,cDNA产物,系列稀释,两个基因的扩增效率,应用之二:基因表达差异分析,4 fold down,3 fold up,应用之二:基因表达差异分析,两条探针分别针对不同等位基因,A,C,G,T,A,C,
6、G,T,应用之三:SNP分析,应用之三:SNP分析,FAM,TET,FAM,TET,应用之三:SNP分析,应用之四:GMO检测,目的:检测食品等中转基因成分的含量,大量的作物被遗传改良来获得一些性状, 如:抗除草剂,抗虫,抗病等,应用之四:GMO检测 抗除草剂的转基因大豆,广泛使用的除草剂的作用成分是草甘膦。 草甘膦是EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶 )的竞争抑制物。在草甘膦存在的条件下,EPSPS的活性被抑制。 植物被转化了一种耐受草甘膦的EPSPS基因,获得抗性。,检测策略 抗性EPSPS基因的量 转基因大豆的量 Lectin基因的量 食品中大豆总量,应用之四:GMO检测,数
7、据处理: C(t)EPSPS-C(t)LectinC(t) %GMO(1+E), Ct,荧光定量PCR仪的硬件条件,激发光源,热循环加热、制冷,检测设备,荧光定量PCR仪应满足的要求,光源的光谱范围宽广,能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.,荧光定量PCR原理及应用 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪,Stratagenes New Mx3000P!,High Performance Personal Price,Stratagene 公司成立于1984年,致力于发展生命科学领域的创新
8、产品与科技. 总部位于美国 La Jolla, California .在欧洲与日本设有分公司.,Stratagene 公司简介,Mx3000P 整体设计,Mx3000P 热循环系统,96 孔样品槽 半导体加热制冷 温度均一性: +/- 0.25C 升降温速率: up to 2.5C/sec,热循环系统,半导体加热制冷 resistive and convective heat exchange 独特的温度补偿条,整板温度均一性 +/- 0.25C 热盖 反应体积10-100ul,Mx3000P 光路系统,PMT,96 well plate,石英卤钨灯,激发光滤镜轮,发射光滤镜轮,扫描式检测,
9、同轴光纤,Mx3000P 光学系统,石英卤钨灯(350-750nm) 2 个滤镜轮 可选择的滤镜: Filter sets: FAM/SYBR, HEX/JOE/VIC, ROX/Texas Red, Cy5, Alexa350, TET, NED/TAMRA, Cy3 1 PMT(光电倍增管)检测器 350-700nm 发射光检测范围 扫描式检测设计,Mx3000P 扫描系统,整板扫描3.5s 滤镜轮旋转进行多通道扫描,激发光源的比较,Lasers: 光强高, 波长范围窄; 石英卤钨灯: 中等光强, 波长范围宽; LED: 光强低, 波长受限制。,Mx3000P 可用荧光染料,荧光滤镜系统,
10、Mx3000P,四通道设计,避免光谱重叠,Mx3000P 发射光滤镜轮,荧光检测系统的发展,PMT光电倍增管 冷CCD CCD Photodiodes光电二极管,荧光检测系统灵敏度比较示意图,PMT (光电倍增管),冷 CCD,CCD,Photodiodes光电二极管,PMT与CCD的检测原理,hv,e-,e-,PMT,CCD,CCD与PMT检测区别,无边缘效应,边缘效应,CCD,Mirror,Simultaneous Illumination/Detection,CCD与PMT检测结果均一性对比,Ct vs. Well number (across plate groupings),Mx30
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