8味单药提取液体外抑制未孢子化卵囊成熟的研究设计与记录.doc
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1、8味单药提取液体外抑制未孢子化卵囊成熟的研究设计与记录筛选对未孢子化卵囊的成熟有抑制作用的中药提取液试验编号: 201403 实 验 人: 王旭川 试验时间: 2014年3月 实验一 8味单药的提取1、 实验目的用水煎法和酒精浸提法提取8味单药的有效成分。2、 实验材料2.1试剂:清水、无水乙醇2.2药品:常山、青蒿、使君子、白头翁、苦参、瑞香狼毒根、苦谏根皮、钩藤2.3器具:铜质碎药钵,大德牌1000g高速摇摆式万能粉碎机(浙江温岭市林大机械制造有限公司)、电子天平、60目筛、砂锅、万用电炉、锥形瓶、试管、容量瓶、量筒等。3、 试验方法3.1水煎法提取:8味单药分别称取10g粉碎,过60目筛
2、,中药粉末用清水浸泡24h,砂锅熬煮30min,取药液,再将剩余药渣加适量清水再熬煮30min,将两次得到的药液混匀,分成两份,其中一份添加适量渗透剂,两种药液分别制成含原药5.0mg/ml的原液。再将两种原液稀释为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10个浓度。将稀释得到的药液装入小瓶中密封,与剩余原液一同放入冰箱冷藏备用。3.2酒精静置法提取:8味单药分别称取10g粉碎,过60目筛,中药粉末置于锥形瓶中,倒入适量无水乙醇,塞上塞子,放入70温箱中,24h
3、后取出药液冷却,分成两份,其中一份添加适量渗透剂,两种药液分别后制成含原药5.0mg/ml的原液。再将两种原液稀释为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml10个浓度。将稀释得到的药液装入小瓶中密封,与剩余原液一同放入冰箱冷藏备用。实验二 艾美耳球虫卵囊对雏鸡的感染试验1、实验目的用柔嫩艾美尔球虫感染雏鸡以便从粪便中收取大量的球虫卵囊2、 实验材料2.1试验用品: 滴管、镊子、剪刀、玻璃棒、锥形瓶、载玻片、桌布、牙签、烧杯、纱布、手套等均应在80干燥箱中烘干消毒
4、30min。2.2饲养室用品:洗衣粉、刷子、汽油喷灯、汽油、塑料布、铁丝、剪刀、氯制剂、氨水、火碱(NaOH)、甲醛(1000ml)、高锰酸钾(500ml)、水(500ml)、灯泡、报纸。2.3试验虫株:柔嫩艾美尔球虫卵囊由中国农业大学动物科技学院病理实验室提供3、 实验方法3.1饲养室的消毒在雏鸡入舍前,先移将动物房清空,清扫干净后,清洗,在动物房干燥后,进行消毒以下。3.1.1冲 先将墙壁、地面、顶棚和其它用具冲洗干净,再用刷子将水槽、料槽和鸡笼刷洗后冲洗干净;3.1.2烧 先将地面的鸡毛与粪便以汽油喷灯烧烤,再将刷干净后鸡笼用汽油喷灯火焰消毒。3.1.3喷洒 消毒要用氯制剂消毒药喷洒地面
5、、屋顶和墙壁,之后地面、地面以上2米的墙壁及其它所有突出墙外的附属设施,然后用3%火碱喷雾和10氨水消毒;用氯制剂消毒药将水槽、料槽浸泡30min以上。3.1.4熏蒸 密闭门窗,进行熏蒸消毒(福尔马林毫升数与高锰酸钾克数之比为2:1。一般按福尔马林30毫升/立方米、高锰酸钾15克/立方米和常水15毫升/立方米计算用量。进行熏蒸消毒时,一般舍温不应低于18,相对湿度以60% 80%为好,不宜低于60%。当舍温在26,相对湿度在80%以上时,消毒效果最好)2448h,用前通风2448h待用。3.1.5电线、塑料布、水槽、料槽的处理80干热放置30min以杀灭球虫卵囊。3.1.6鸡笼处理用塑料布包裹
6、消过毒的鸡笼,将40W的灯泡接于鸡笼中,提前12h开启灯泡,使温度能均衡保持在34左右,并用干湿温度计测定湿度,使其能均衡保持在6065%左右,准备养鸡。3.2球虫含量检测及攻毒剂量的确定 3.2.1用具:塑料布、生理盐水、离心管、载玻片、玻璃棒、移液管、盖玻片、计数板3.2.2用血球计数板计数,计算所用球虫卵囊的含量,并对球虫卵囊做稀释或离心处理,并确定攻毒剂量。3.3增值方法:3.3.1用具:手套、注射器、输液针头、饲料、凉白开、消毒剂3.3.2健康检查:(试验前) 一般采用“五点梅花法”取被检动物或动物群的新鲜粪便l0g,进行健康检查。 (1)取被检动物或动物群的新鲜粪便l0g,放入50
7、mL烧杯中,加入适量水。(2)轻轻搅匀,经60目铜丝网或尼龙网过滤。(3)将滤液移入4支10 mL15 mL试管,2500rmin离心l0min。(4)倾去上清液,各管沉淀物中加入少量饱和盐水,混匀。各管的沉淀物混悬液移入一个5mL玻璃瓶。(5)用饱和盐水加满,盖上盖玻片(盖玻片须能与液面接触),静置10min。(6)取下盖玻片,放在载玻片上。(7)置载玻片于显微镜台上,用l010或1040的倍数进行检查。(8)判定:如果视野中发现球虫卵囊,可判定为阳性,即说明该动物(群)己受到球虫的感染。未发现球虫卵囊,需重复检查5次,仍未见球虫卵囊,本粪样可判为阴性。只有连续检查粪便7d10d,均未发现球
8、虫卵囊,方可说明该动物(群)未感染球虫。3.3.3鸡群攻毒:经灌胃前五天连续镜检试验鸡粪便,均无发现球虫卵囊后,分别对健康的 日龄小公鸡以 5000个孢子化卵囊/只灌胃,具体操作:确定攻毒剂量后,将一次性输液器管插入鸡嗉囊中,用注射器将球虫卵囊轻轻推入。灌胃后在无球虫环境中饲喂雏鸡标准料,饲料中添加1600mg/kg的土霉素和1800mg/kg的制菌磺,饲料和饮水中不能含有球虫(高压灭菌)。养鸡过程中注意鸡舍的清洁与卫生,出现病死鸡及时剖检,查找病因。收集接种后第139168h粪便及168h盲肠中的球虫卵囊,同时镜检其他肠段有无球虫。实验三 球虫卵囊的收集1、实验目的从感染了柔嫩艾美尔球虫的鸡
9、的粪便中回收球虫卵囊2、实验材料 2.1试剂 洗洁精( 5ml ) 生产厂家:广州立白企业集团有限公司 批号:70140215K70118乙酸(5ml)生产厂家:太原溶剂厂 批号:HG3-1095-77、食盐生产厂家:山西省盐业公司 批号:GF610802100095、凉开水(1桶) 2.2用品和仪器:天平(HC-TP12A-20),玻璃棒(4个)、18目筛(1mm)、80目筛(孔径约0.2mm)、200目筛(孔径约0.075mm)、离心机3个(DD5M aida)(Anke LXJ-IIB)(LXJ-)、烧杯15个、15ml离心管6支、血球计数板1个、麦卡玛斯特计数板1个、温箱(XMTD M
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