修饰动物模型的建立及应用.ppt
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1、第二十二章,常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application,生物科学与技术学院,第 一 节 分子杂交与印迹技术 Molecular Hybridization & Blotting Technology,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ),一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,RNA,DNA,核酸分子杂交的原理,带有某种标记的核酸单链作为探针,在一定条件下, 按碱基互补配对原则与互补的核酸单链退火形成双链杂交体, 鉴定靶序列的存在、分
2、子大小或进行靶序列的相对定量分析。,核酸分子杂交的杂交动力学,核酸分子杂交 核心序列形成 自发过程,(一)印迹技术 (二)探针技术,探针 (probe),探针的来源,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针,二、印迹技术的类别及应用,(一)DNA印迹技术 (Southern blotting),(二)RNA印迹技术 (Northern blotting),(三)蛋白质的印迹分析 (Western blotting),其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA
3、 chip),核酸杂交技术,(一)Southern Blot 原理,用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。,Southern Blot 操作步骤:,DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交(变性探针) 洗膜 放射自显影或显色,斑点印迹杂交(Dot blot),斑点印迹 优点-简单、迅速;核酸粗提、多样品检测 缺点-不确定分子量、特异性不高,假阳性,原位杂交 (In Situ hybridization),标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交。 1969, Pardue -爪蟾核糖体基因探针 1970, Orth -兔乳头状瘤病毒
4、cDNA探针,Western Blot 原理,操作过程,SDS-PAGE电泳 转膜(PVDF或硝酸纤维素膜) 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影,Hours 0 4 8 16,Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3/Bcl-2. Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was
5、 loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.,注意的问题,蛋白质电泳 常用SDS-PAGE 非变性PAGE Tris-Tricine胶中电泳,聚丙烯酰胺具有神经毒性,操作时要戴手套,三种印迹技术的比较,目 录,放射自显影照片,目 录,DNA芯片: (Bio-chip、DNA arrays、Oligonucleotide microchip) 特点:高度并行性,多样性,微型化和自动化。,DNA芯片,Assay Formats,Normal Sample,DNA micrarr
6、ay robot enclosed in a temperature and humidity controlled environment.,Research Use From Sequence to function,计算Ratio 值 (= Cy3/Cy5) 在 0.5-2.0 之外的定义为在两样本中有明显差异表达。进而获取初步功能信息。 Clustering,芯片杂交结果示意图,DNA点阵,目 录,DNA芯片技术的主要应用, 分析基因组、发现新基因 基因表达的研究 DNA序列分析 基因诊断 基因药物设计,第 二 节 聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reacti
7、on,PCR技术发展简史 (1)PCR的最早设想 (2)PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 (3) PCR的改进与完善,耐热的DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶于1988年saiki从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。该菌株于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离到。基因全长2,499bp,编码分子量为94 kd、长度为832个氨基酸的蛋白质。,聚合酶链式反应(PCR)原理 PCR是Kary Mullis于1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程,即利用DNA 聚合酶
8、(如Taq DNA聚合酶)等在体外条件下,催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、基本工作原理,目 录,目 录,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,二、PCR体系基本组成成分,三、PCR的基本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,PCR thermal cyclers,平台期与平台效应(plateau effect) PCR经过一定数量的循环后,随着产物的对数累积趋于饱和,DNA片段不再呈指数积累,而是进入线性增长期或静止期,此过程称为平台效应。,PC
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