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1、,第一章 蛋白质,第一节 蛋白质的生物学意义及化学组成,一、蛋白质的生物学意义,蛋白质是生命的物质基础 蛋白质和核酸是构成细胞原生质的主要成分,原生质是生命现象的物质基础,而生物化学研究的正是生命的化学。 蛋白质几乎参与了所有的生物结构与生命过程,二、蛋白质的化学组成,生物界蛋白质种类估计在1010-1012数量级,如此众多的蛋白质其元素组成是不是很复杂呢?,1、蛋白质的元素组成,五种主要元素 C (50-55%) H (6-8%) O (20-23%) N (15-18%) 蛋白质含量=蛋白氮6.25(凯氏定氮法) S (1-4%) 其它元素:P、Fe、Cu、Zn、I、Mo等,2、蛋白质的基
2、本单位,自然界任何蛋白质纯品经酸、碱、酶彻底水解后,所得的最终产物都是氨基酸(Amino acid, AA),因此氨基酸是蛋白质的基本单位。,2、蛋白质的基本单位,酸水解 条件: 6 mol/L HCl或4 mol/L H2SO4 ,105-110 下回流煮沸20h; 优点:不引起水解产物消旋,得到L-型AA; 缺点:色氨酸被完全破坏,产生腐黑质;含有羟 基和酰胺基的氨基酸部分被破坏。 碱水解 条件: 5mol/L NaOH,煮沸10-20h; 优点:色氨酸在水解中不受破坏 ; 缺点:许多氨基酸都受到不同程度的破坏,产率 不高;部分的水解产物发生消旋化。,2、蛋白质的基本单位,酶水解 条件:蛋
3、白水解酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜 蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶 等)常温37-40, pH值5-8; 优点:不破坏氨基酸,不发生消旋,水解液清亮; 缺点:用一种酶常常水解不彻底,产物多为较小 的肽段,所需时间长。,前两种水解法常用于蛋白质的组成分析,酶水解常用于制备蛋白质水解产物,第二节 氨基酸,一、氨基酸的分类,自然界中天然存在的氨基酸有20多种,它们以不同的数量、比例及排列顺序组成了数以万计的蛋白质家族。在学习蛋白质之前,我们先来了解其基本单位氨基酸的分类情况。,(一)、常见的蛋白质氨基酸,这类氨基酸有20种,它们由相应的遗传密码编码(新发现两种:硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸)。除P
4、ro外,与羧基相邻的-碳原子都连有一个氨基,因此它们被称为-AA,可用结构通式表示:,常见的蛋白质氨基酸-1,常见的蛋白质氨基酸-2,常见的蛋白质氨基酸-3,常见的蛋白质氨基酸-4,常见的蛋白质氨基酸-5,常见的蛋白质氨基酸-6,二十种氨基酸的结构特点,支链氨基酸:缬氨酸、亮氨酸,异亮氨酸; 含羟基氨基酸:丝氨酸、苏氨酸; 含硫氨基酸:半胱氨酸(巯基) 甲硫氨酸(硫甲基); 含苯环氨基酸:苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸(酚羟基); 含胍基氨基酸:精氨酸; 含咪唑基氨基酸:组氨酸; 亚氨基酸:脯氨酸; 含酰胺氨基酸:天冬酰胺、谷氨酰胺; 含吲哚基氨基酸:色氨酸; 含-氨基氨基酸:赖氨酸;,1、按侧链R
5、基结构特点分类,(1)脂肪族: 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸; (2)芳香族 :苯丙氨酸、酪氨酸; (3)杂环族:色氨酸、组氨酸; (4)杂环亚类:脯氨酸;,2、按羧基与氨基的数目分类,(1)一氨基一羧基: 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺; (2)二氨基一羧基: 赖氨酸、精氨酸、组氨酸; (3)一氨基二羧基: 天冬氨酸、谷氨酸;,3、按侧链R基极性分类,(1)非极性氨基酸 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、
6、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋/甲硫氨酸; (2)极性不带电荷氨基酸 甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺; (3)极性带正电荷:碱性氨基酸 赖氨酸、精氨酸、组氨酸; (4)极性带负电荷:酸性氨基酸 天冬氨酸、谷氨酸;,4、按营养学的角度分类,(1)必需AA 在生物体内不能合成或合成量不足以维持正常的生长发育,必须依赖食物供给的氨基酸。成人有8种,分别为赖、蛋、色、苯丙、亮、异亮、缬和苏氨酸;婴幼儿时期还需加上组氨酸和精氨酸。 猪(+组、精);鸡(+组、精、甘、胱、酪); (2)非必需AA 指机体能由简单的前体合成,不需要从食物中获得的氨基酸。,(二)、稀有的蛋
7、白质氨基酸,从少数蛋白质中分离出一些稀有氨基酸,它们由常见的基本氨基酸衍生而来,本身没有相应的遗传密码。 凝血酶原中的-羧基谷氨酸; 肌动蛋白中的6-氮甲基赖氨酸; 胶原蛋白和弹性蛋白中的4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸,(三)、非蛋白质氨基酸,以游离状态或结合状态存在于细胞或组织中,但不参于组成蛋白质,故称为非蛋白质氨基酸。植物中较多,多数功能尚不清楚。 短杆菌肽S中的D-苯丙氨酸; -氨基丁酸是一种神经递质; -丙氨酸是泛酸的前体; 瓜氨酸、鸟氨酸是尿素循环的中间体;,二、氨基酸的理化性质,一般物理性质 形态:均为白色结晶或粉末,不同氨基酸的晶型结构不同; 溶解性:一般溶于水,不溶或微溶于醇,不
8、溶于丙酮,在稀酸和稀碱中溶解性好; 熔点:熔点一般较高,通常大于200,超过熔点以上氨基酸会分解产生胺和二氧化碳。,(一)、两性性质与等电点,氨基酸处在结晶形态或在水溶液中时,其氨基和羧基分别以质子化(-NH3+)形式和离解状态(- COO-)存在。此时的氨基酸即可以作为碱接受H+ ,又可以作为酸电离出H+ ,因而它具有酸碱两性性质。,从上图可知:氨基酸在酸性环境中,主要以阳离子的形式存在;在碱性环境中,主要以阴离子的形式存在;只有在一定pH值下,以两性离子(兼性离子)的形式存在。 等电点:氨基酸所带正负电荷相等时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。等电点时氨基酸溶解度最小。,pH=pI时,净电
9、荷为零 pHpI时,净电荷为“-” 一定pH范围内,氨基酸溶液的pH离等电点越远,所带净电荷越大,可利用此性质分离各种氨基酸。 利用丁醇-乙酸,一向展层;苯酚-甲酚-水,二向展层分离各种氨基酸。,氨基酸完全质子化时,可以看成多元酸,以甘氨酸为例说明氨基酸的解离情况,侧链可解离的氨基酸呢?,组氨酸是pK值唯一在7 附近的氨基酸,血红蛋白中含有较多His残基,这使得它具有显著的缓冲能力。,(二)、氨基酸的光学性质,1、旋光性,构成蛋白质的氨基酸除甘氨酸外,均含有手性-碳原子,与该-碳原子相连的四个原子或基团在空间可以有两种排列方式:L-构型与D-构型。给定氨基酸的一种异构体溶液在旋光计上使偏振光平
10、面右旋,它的另一个异构体就使偏振光平面左旋。这种能使偏振光的偏振面发生旋转的性质称作旋光性。 右旋体:偏振面顺时旋转,用(+)或d表示; 左旋体:偏振面逆时旋转,用()或l表示;,1、旋光性,各氨基酸的构型是与甘油醛比较而确定的。甘油醛的构型由X-射线结构分析确立(相对/绝对构型)。,1、旋光性,有些氨基酸除-碳原子外,还有第二个手性碳原子。如羟脯氨酸、羟赖氨酸、苏氨酸等。,1、旋光性,对映体、非对映体、(外)消旋物、内消旋物,1、旋光性,天然蛋白质氨基酸绝大多数为L-型,近年在某些微生物蛋白质中发现有-型AA; 在实验室有机合成的AA为D-型和L-型的混合物,长时间放置,L-型会转变为D-型
11、; 含有手性碳原子的化合物都有旋光异构体,但不一定有旋光性。 构型与旋光方向无直接对应关系; 同一种L-型AA在不同溶剂中测定时,其比旋光值和旋光方向也会不同。,2、吸光性,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收;在远紫外区(220nm)均有光吸收;在近紫外区(220-300nm)只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收光的能力。因为它们具有苯环共轭双键系统。它们的最大光吸收分别在280nm、275nm和257nm。,(三)、氨基酸的重要化学性质,1、-氨基参加的反应 (1)亚硝酸反应:反应放出氮气,氮气一半来自氨基氮,一半来自亚硝酸,通常情况下测定生成的氮气的体积量即可计算氨基酸的量,此反
12、应可用于测定蛋白质的水解程度。 (2)甲醛反应:间接滴定法。,(三)、氨基酸的重要化学性质,1、-氨基参加的反应 (3)Sanger反应:(与2,4-二硝基氟苯反应)DNFB只与多肽或蛋白质N端的AA起反应,生成DNP-多肽或DNP-蛋白质,当用酸水解时,所有的肽键被切开,只有DNP基仍连在N端AA上,形成黄色的DNP-AA,利用DNP-AA在有机溶剂中的溶解度与其他AA不同,可以用乙醚把DNP-AA抽提出来,从而与其他AA分开,所得DNP-AA经纸层析,从纸层析图谱上黄色斑点的位置可鉴定N端AA的种类和数目。,(三)、氨基酸的重要化学性质,1、-氨基参加的反应 (4)Edman反应:(与苯异
13、硫氰酸酯反应) 蛋白质多肽链N末端AA的-氨基也可以与PITC发生上述反应生成PTH-多肽,在酸性溶液中释放出末端的PTH-AA和比原来少一个AA残基的多肽链,所得的PTH-AA用层析法鉴定,即可确定肽链N末端AA的种类。剩余的肽链重复应用此方法测定其N端的第二个AA,如此重复就可测定多肽链全部序列。目前根据此原理设计出蛋白质顺序测定仪,大大提高了蛋白质测序的效率。,(三)、氨基酸的重要化学性质,1、-氨基参加的反应 (5)DNS-Cl反应:(与丹磺酰氯反应) 此法与DNFB法测定多肽链N-末端原理相同。丹磺酰基具有强烈荧光,灵敏度比DNFB高100倍,且水解后的DNS-AA不需提取,可直接用
14、纸电泳或薄层层析鉴定N-末端。,(三)、氨基酸的重要化学性质,2、-羧基参加的反应 (1)与碱反应成盐 (2)与醇反应成酯 (3)与酰化试剂反应成酰氯,(三)、氨基酸的重要化学性质,3、-氨基和-羧基共同参加的反应 茚三酮反应:除脯氨酸与羟脯氨酸外,可与其它-氨基酸生成蓝紫色化合物。脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。,(三)、氨基酸的重要化学性质,4、侧链反应(颜色反应) (1) Millon反应:检测Tyr; Millon试剂:汞的硝酸盐与亚硝酸盐溶液; 产物:红色的化合物。 (2) Folin反应:检测Tyr、Trp; Folin试剂:磷钼酸、磷钨酸及碱性硫酸铜混合溶液; 产物:蓝色的钼蓝、钨
15、蓝。 (3) 坂口反应:检测Arg; 坂口试剂:-萘酚的碱性次溴酸钠溶液; 产物:红色沉淀。,(三)、氨基酸的重要化学性质,4、侧链反应(颜色反应) (4)Pauly反应:检测His、Tyr; 试剂:对氨基苯磺酸盐酸溶液、亚硝酸钠、碳酸钠混合溶液 ; 产物:橘红色的化合物。 (5)乙醛酸反应:检测Trp。 试剂:乙醛酸和浓硫酸; 现象:在试管中叠加时,产生分层现象,界面出现紫色环。 (6) Cys反应:检测Cys; 试剂:亚硝基亚铁氰酸钠在稀氨的溶液; 产物:砖红色的沉淀。,我们学习了什么?,蛋白质的生物学意义与化学组成 蛋白质基本单位是氨基酸 从结构特点理解氨基酸的分类 氨基酸的两性性质及等电点 掌握等重要的反应及其应用,如Sanger反应、Edman反应、茚三酮反应。,练一练,构成蛋白质的20种氨基酸都具有旋光性。( ) 在近紫外区只有 、 和 有吸收光的能力。 下列氨基酸中,哪一个能与茚三酮反应生成黄色物质 A、Lys B 、Ser C、Pro D、Trp,色氨酸、酪氨酸 苯丙氨酸,
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