大肠杆菌来源的HPV6_L1重组蛋白的基础及应_用研究博士论文.doc
《大肠杆菌来源的HPV6_L1重组蛋白的基础及应_用研究博士论文.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《大肠杆菌来源的HPV6_L1重组蛋白的基础及应_用研究博士论文.doc(165页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、学校编码:10384 分类号 密级 学号:B200426027 UDC 博 士 学 位 论 文 大肠杆菌来源的HPV6 L1重组蛋白的基础及应用研究Basic and Application Studies on E. coli Derived HPV6 L1 Recombinant Protein潘晖榕指导教师姓名:夏宁邵 教授专 业 名 称:生物化学与分子生物学论文提交日期:2008年11月论文答辩时间:200年12月学位授予日期: 答辩委员会主席:田德英 评 阅 人: 2008年 11 月161目录目录目录I摘要1Abstract3缩略词5前言71.HPV研究回顾72.HPV的结构72.
2、1.HPV基因组结构72.2.HPV的早期蛋白82.3.HPV晚期蛋白与病毒结构102.4.二硫键与HPV 颗粒结构132.5.L1蛋白的自组装142.7.L2蛋白153.HPV的分型164.HPV的感染以及致病机制175.HPV的免疫195.1.抗HPV的天然免疫205.2.抗HPV的特异性免疫205.3.HPV免疫低反应性以及免疫逃逸的机制226.HPV感染的诊断236.1.HPV DNA检测236.2.HPV抗体检测247.HPV流行情况以及所致疾病247.1.高危型与低危型HPV247.2.HPV感染的传播257.3.HPV感染的流行情况257.4.高危型HPV感染所致疾病297.5.
3、低危型HPV感染所致疾病298.HPV疫苗研究现状328.1.HPV疫苗的基本要求328.2.现有的HPV疫苗339.蛋白质结构研究及预测389.1.蛋白质结构研究的实验方法389.2.蛋白质结构研究的预测方法399.3.蛋白结构预测在抗体模拟上的应用459.4.抗体模拟技术的应用前景:4610.B细胞抗原表位定位的研究方法4710.1.B细胞表位的预测法4710.2.B细胞表位定位的实验方法4911.本文研究的思路,目的和意义51材料与方法531.材料531.1.主要设备531.2.菌株、质粒、实验动物541.3.工作站、软件及其使用模块551.4.酶和单抗552.方法552.1常用溶液及培
4、养基配制552.2常规分子生物学实验方法572.3HPV6 L1相关的克隆构建,表达纯化以及检测方法622.4疫苗原液及成品检定方法662.5分析型超速离心机相关操作672.6蛋白质晶体培养692.7圆二色光谱测定702.8抗HPV6标准血清的制备702.9HPV6单抗的制备,鉴定与CDR区测序712.10分子模拟与分子对接77结果与分析81第一部分HPV6 VLP疫苗的研究811.HPV6 VLP小量制备方法的建立811.1.大肠杆菌重组表达质粒pTO-T7-6N5C的构建811.2.HPV6N5-Ll在大肠杆菌中的可溶性表达821.3.重组蛋白HPV6N5-Ll的色谱纯化841.4.HPV
5、6VLP组装条件的摸索871.5.小结902.HPV6 VLP疫苗的中试研究902.1.HPV6N5C-L1的高密度发酵表达902.2.HPV6N5C-L1的中试规模粗纯902.3.HPV6N5C-L1的中试规模色谱纯化912.4.HPV6 VLP的大量组装922.5.HPV6 VLP疫苗中试工艺的评价932.6.小结953.HPV6 VLP疫苗免疫原性的考察964.HPV6 VLP疫苗原液稳定性的考察985.第一部分小结103第二部分HPV6 VLP疫苗的结构分析及表位定位1031.HPV6 VLP疫苗的结构分析1031.1.HPV6N5C-L1一级结构的研究:1031.2.HPV6N5C-
6、L1二级结构的研究1051.3.HPV6N5C-L1 五聚体结构的研究1051.4.HPV6N5C-L1 VLP结构的研究1131.5.小结1152.HPV6 VLP疫苗表位的定位1152.1.HPV6单抗的筛选以及鉴定1162.2.利用分子对接技术预测HPV6 VLP疫苗的优势表位1212.3.利用同源扫描法进行HPV6 VLP疫苗优势中和表位的定位1282.4.预测表位与实验确定表位的比较1312.5.小结1323.第二部分小结133讨论1341.大肠杆菌表达系统在HPV VLP疫苗研究中的应用1342.HPV抗体的检测1363.HPV疫苗的发展趋势139小结与展望143参考文献144致谢
7、153在校期间发表论文及申请专利154摘要大肠杆菌来源的HPV6 L1重组蛋白的基础及应用研究摘要人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus HPV)能够引起肛生殖器部位的多种良性及恶性病变。在HPV感染所致疾病中,尖锐湿疣是一种相当常见的性传播疾病。虽然该疾病为良性病变,但是具有反复发作,不易痊愈的特点,往往会给患者带来沉重的心理压力及经济负担。尖锐湿疣主要由HPV6及HPV11感染所引起,其中由HPV6感染所引起的占到了70%。因此,一种有效的HPV6疫苗能够显著减少尖锐湿疣的发生和传播。研究表明HPV L1蛋白在体外组装而成的类病毒颗粒(Virus-Like Particle
8、 VLP)是一种良好的HPV疫苗形式,可以诱导高滴度的抗HPV中和抗体。目前,已有两种HPV VLP疫苗上市,其安全性及有效性也得到了充份的证实。但是上述两种疫苗均采用真核表达系统,生产成本高,产品价格昂贵,难以在发展中国家推广。而大肠杆菌表达系统具有培养条件简单,生产成本低廉的突出优点。若将其应用于HPV6 VLP疫苗的研究中将能够降低疫苗成本,促进该疫苗在发展中国家的推广。本研究尝试利用大肠杆菌表达系统制备具有良好免疫原性及稳定的HPV疫苗,并对该疫苗的结构及表位进行分析。在本研究中并未以包涵体的形式在大肠杆菌中表达重组蛋白HPV6N5C-L1,而是将目的蛋白以非融合的形式可溶地表达于大肠
9、杆菌中。所表达的HPV6N5C-L1蛋白在经过盐析沉淀,复溶,阳离子交换色谱,疏水相互作用色谱这一系列纯化步骤之后,其纯度能够达到96%以上。经纯化的HPV6N5C-L1很好的保持了其天然构象,可以在缓冲液(10mmol/L PB pH6.0,150mmol/L NaCl)中组装为半径约为25nm左右的空心颗粒,具有典型的HPV6 VLP的形态结构。在上述HPV6 VLP小量制备方法基础上,本研究进一步进行了HPV6 VLP疫苗的中试研究,以便建立高效,稳定的HPV6 VLP中试工艺。研究结果显示,该工艺不但具有25%左右的较高得率,而且对于目的蛋白具有良好的纯化效果。经过纯化,目的蛋白的纯度
10、能够达到96%以上,而内毒素,外源DNA含量均能够符合药典要求。此外,通过对三批次中试的观察,证实了该工艺同时具有良好的稳定性。中试研究所制备的HPV6 VLP疫苗需要进一步进行免疫原性及稳定性考察。实验结果显示,本研究制备的HPV6 VLP疫苗的ED50为0.009g,低于对照组中Merck HPV疫苗Gardasil的0.016g。在稳定性研究中,HPV6 VLP疫苗原液在25放置7Day后,其平均水化半径,HPLC保留时间,沉降系数,体外相对抗原含量均未发生明显变化。在37放置7天后,HPV6 VLP的平均水化半径有略微增大,而其余检测指标也未见明显变化。上述研究结果证实了本研究所制备的
11、HPV6 VLP具有良好的免疫原性及稳定性。由于HPV VLP具有复杂的空间构象,而且HPV疫苗的效果也严格依赖于其正确的空间构象的形成。因此本研究在成功制备HPV6 VLP疫苗的基础上进一步对该疫苗的结构及抗原表位进行研究,以阐明HPV6 VLP的结构及表位特征,为建立全面的疫苗质控体系及进行疫苗设计奠定基础。结构分析显示,组成大肠杆菌来源HPV6 VLP的五聚体在大小,分子量上均与理论值吻合,并且在一定条件下能够形成晶体,具有正确的构象。而HPV6 VLP为空心圆形颗粒,平均约半径为25nm,表面可见壳粒,具有典型的HPV VLP的特征,与真核来源的HPV VLP无异。通过对多个中试批次样
12、品进行分析,可以发现所制备的HPV6 VLP在颗粒半径,保留时间,沉降系数等指标上具有高度的一致性。在表位研究中,本研究筛选得到了HPV6 优势中和单抗7A8,13H5,这两株单抗同时还具有HPV6/11交叉中和活性。利用这两株单抗模型与HPV6 五聚体模型的分子对接,可以将HPV6 的优势中和表位定位于HPV6 VLP表面的DE,FG,HI三个环状区域上。而后进一步通过同源扫描的方法验证了上述对接结果,并且进一步将上述表位定位于HPV6 VLP表面的三个区域:V138N139V140G141 ,E259V260G261E262P263V264P265D266 T267L268 I269I27
13、0, S345T346 Y347T348 N349 S350 D351Y352。综合上述结果,本研究成功利用大肠杆菌表达系统制备了HPV6 VLP疫苗,验证了其稳定性,有效性及结构正确性,并且对其优势中和表位进行了定位。这些工作将为HPV6 疫苗研究及新型HPV疫苗设计提供参考。关键词:人乳头瘤病毒6型 晚期蛋白L1 大肠杆菌表达系统 类病毒颗粒 疫苗 表位定位AbstractBasic and Application Studies on E. coli Derived HPV6 L1 Recombinant Protein AbstractHuman papillomavirus (HPV
14、) can cause lesions ranging in severity from benign Condyloma Acuminatum (CA) to malignant in cervical cancer in human anogenital tract. And CA is one of the most common sexual transmitted diseases. Because of frequency of recurrences after treatment, this disease can bring huge economic burden and
15、become a very significant public health problem. Recent studies have shown that about 70% of CA cases are caused by HPV6. So an effective vaccine against HPV6 would greatly reduce CA incidence.Studies had showed HPV L1 can assemble into VLP (Virus-like particle) spontaneously in vitro. The VLPs morp
16、hologically and immunologically resemble native capsids and can elite high titer neutralization antibodies and protect human from homologous genotype HPV infection and had been confirmed to be a good HPV vaccine candidate. There are two available HPV VLP vaccines now and all are proved to be safe an
17、d efficient. But both of these two vaccines are derived from eukaryotic expression system and the high manufacturing cost would make them not be ideal for used in developing countries. E. coli expression system has been widely used in producing many recombinant DNA pharmaceuticals because of it is e
18、asy to transform, grows quickly in simple media, and requires inexpensive equipment for growth and storage. So a highly immunogenicity and low in manufacturing HPV6 vaccine prepared with E. coli expression system will make it ideal for used in developing countries. In this study E. coli expression s
19、ystem was used to develop a cheap and efficient HPV6 VLP vaccine. And the structure and epitopes of HPV 6 VLP were studied too.Not like other studies, HPV6N5C-L1 was expressed in no-fusion soluble form in E. Coil. And after purified by salting, ion-exchange chromatography, and hydrophobic interactio
20、n chromatography, the purity of HPV6N5C-L1 can reach 96%. The purified HPV6N5C-L1 kept its native confirms and can assemble into typical HPV VLP with the radius of about 25nm in the buffer of 10mmol/L PB pH6.0, 150mmol/L NaCl.The pilot study of HPV6 VLP vaccine was proceed on the base of lab scale p
21、reparation process. And the results showed the recovery rate of the process was above 25%. The purity of HPV6N5C-L1 can reach 96% and the content of residual extraneous DNA, residual host bacterial protein and bacteria endotoxin can meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia. The data of 3 batch
22、es further showed the scale up processs stability.In the study of HPV6 VLP vaccines antigencity, the results showed E. coli derived HPV6 VLP vaccines ED50 was 0.009g.This is lower than Mercks 0.016g. And after stored in 25 for 7Day, the radius, HPLC retain time, sedimentation coefficient and related
23、 in-vitro potency of HPV6 VLP didnt change obviously. The radius of HPV6 VLP stored in 37 for 7Day change from 27.64 nm to 29.81nm, but there were not other obvious change. So the E. coli derived HPV6 VLP vaccine was proved to antigencity and stability.It is well know that HPV6 VLP vaccines efficien
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 大肠杆菌 来源 HPV6_L1 重组 蛋白 基础 研究 博士论文
链接地址:https://www.31doc.com/p-3315231.html