外源基因在真核细胞中表达及调控.ppt
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1、第七章 外源基因在真核细胞中表达及调控,第一节 真核细胞基因表达的调控 第二节 哺乳动物细胞表达系统的选择 标记基因 第三节 真核细胞表达系统的载体种类,第一节 真核细胞基因表达的调控,一、真核生物基因表达的特点及优势 二、真核细胞表达及调控元件,第二节 哺乳动物细胞表达系统的选择标记基因,一、胸苷激酶基因选择标记(定义) 二、二氢叶酸还原酶基因选择标记 三、新霉素抗性基因选择标记 四、氯霉素已酰转移酶基因选择标记 五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶(XGPRT)基因,第三节 真核细胞表达系统的载体种类,一、载体的类型 二、几种常用的真核表达载体,一、 真核生物基因表达的特点及优势,1.细胞的全能性 2
2、.转录和翻译分开进行 3.有相当大的非编码区(调控序列) 4.有三种不同RNA聚合酶参与转录 5.初级转录产物能进行剪接加工修饰 6.不存在操纵子结构 7.基因多拷贝,功能基因分散在不同区域,分别转录,二、真核细胞表达及调控元件,(一)真核生物基因转录水平的调控 (二)转录后水平的调控 (三)翻译水平的调控,胸苷激酶,胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶(thymidine Kinase,TK)在所有真核细胞中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶, 它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成dTTP, 参与DNA的生物合成。,一、载体的类型,1.质粒型载体 2.病毒载体 3.
3、整合型表达载体 4.游离型表达载体 5.瞬时表达载体 6.稳定性表达载体 7.非复制性HSV-病毒(单纯疱疹病毒HSV-型)载体 8.裂解性HSV-病毒载体,二、几种常用的真核表达载体, 逆转录病毒载体 1.卸甲载体 2.穿梭载体 痘类病毒载体 HSV-单纯疱疹病毒载体 1.重组病毒型载体 2.重组质粒型载体 3.裂解型病毒载体,(一)真核生物基因转录水平的调控,基因调控的顺式作用元件 启动子 增强子 RNA剪接信号 负调控元件 终止子和polyA信号 基因调控的反式作用因子 概念 反式作用因子主要作用规律,(二)转录后水平的调控,mRNA前体加工:转录的mRNA前体经5加帽,3酶切加尾去除内
4、含子后,产生成熟mRNA,通过核孔进入胞质中。 RNA编辑(RNA editing),(三)翻译水平的调控,翻译起始序列 eIF-2的磷酸化反应 由模板来源的遗传信息,进而可编码产生不同氨基酸序列的多种蛋白质,这是生物适应性的保护措施。,顺式作用元件,顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录按效应和功能可分为启动子、增强子、RNA间接信号、负调控元件、终止子等调控元件。,反式作用因子主要作用规律,同一DNA序列可被不同蛋白质识别 同一蛋白质因子可与多种不同DNA序列发生联系,多数是通过蛋白质-蛋白质先
5、相互作用后,再与DNA结合,发挥调节作用。 反式作用因子的自身生物合成有相当大的可变性、可塑性。反式作用因子与顺式作用元件相互作用的特定结构域,有两种类型: 通用转录因子的结构域为识别特异DNA的DNA结合结构域,如:锌指结构。 转录调节因子的结构域又称转录活化结构域,如:酸性-螺旋结构域。 不同结构域各自的特征,不同结构域各自的特征,通用转录因子的DNA结合结构域 锌指结构 亮氨酸拉链 螺旋-转角-螺旋(HTH) 螺旋-环-螺旋 转录调节因子的转录活化结构域,RNA编辑(RNA editing),RNA编辑是在转录时或转录后,能够改变RNA分子编码特性,是与剪切形式不同的一种修饰形式,如可使
6、mRNA某位点密码子CAA转变为UAA,使C变U,编辑的结果形成了UAA终止密码子,在编码酶的作用下,除使C变U,还可在RNA上添加多个U或呈单个C的添加,使前体mRNA变成成熟mRNA时,通过插入或替换方式,可改变和扩大原遗传信息,编码多种蛋白,是生物的适应性保护。,翻译起始序列,在ATG起始密码子周围要有5-CCACCA-TGG-3保守序列,以利mRNA翻译起始,若发生突变,其翻译水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比较多的二级结构序列,也会影响翻译,建议外源基因的5端AUG上游序列不宜过长。,eIF-2的磷酸化反应,eIF-2为转译起始因子-2是蛋白质合成起始阶段13种起始因子中最为关
7、注的因子。若转入动物细胞中的质粒DNA的两条链一旦都发生转录,就会形成双链互补mRNA,而激活胞内的双链RNA激活的蛋白激酶(DAI PK)该激酶可使eIF-2的-亚基磷酸化,转译受抑,为防止该激酶活化,常在载体上加上腺病毒的VARNA基因,VARNA是由RNA聚合酶合成的小分子RNA,能阻止双链RNA对DAI激酶的激活作用,使转译得以正常进行。,一、胸苷激酶基因选择标记,外源基因+载体(TK+)的重组体导入TK-细胞中,在HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷)选择培养基中筛选,TK-细胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡,TK+细胞可存活,以此进行筛选。(HSV-1的TK基因转染细胞加
8、GCV后被杀死,如小鼠LMTK-细胞。) 注:TK+BrUdR因掺入后对紫外线敏感而死亡, TK-+BrUdR因不掺入,对紫外线不敏感而存活。,二、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)选择标记,DHFR是合成dATP和dGTP的关键酶。常用DHFR的CHO细胞因不能合成四氢叶酸,只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基中生长。在不含该培养基中导入该标记基因重组子,则可筛选出阳性克隆,也可将DHFR基因置在强启动子下高表达或通过DHFR基因突变以提高抵抗高浓度氨甲喋呤(抗MTX的抗性)的能力,从而筛选阳性克隆。,三、新霉素抗性基因选择标记,新霉素类似物G418抗生素,可影响80s 核糖体RNA功能,
9、对细胞有毒性。新霉素抗性基因neo的载体可在真核细胞中表达产生新霉素磷酸转移酶能使G418失活,可在含G418培养基中筛选重组体转化的阳性克隆细胞。阳性克隆存活,阴性者死亡。,五、黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶(XGPRT)基因,哺乳动物细胞无XGPRT酶,不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤磷酸(XMP),但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT),可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤磷酸(IMP)。哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸,抑制了GMP的合成,使细胞失去合成DNA能力而死亡。 将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后,在转化细胞中就能表达XGPRT酶,可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中
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