DNA重组和基因转移.ppt
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1、第七章 DNA重组和基因转移,第一节 目的基因与载体的连接,一、粘末端DNA片段的连接,(一)具有相同粘末端的DNA分子之间的连接,使用碱性磷酸酶处理载体DNA,去掉其5末端的磷酸基,以防质粒DNA的自身环化 。,(二)具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接,用两种不同的限制性内切酶对载体和外源DNA进行切割后,在它们两端会产生非互补的突出端,经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。,质粒载体的定向重组,二、平末端DNA片段的连接,1、直接用T4连接酶连接,2、同聚物加尾法,3、衔接物连接法,衔接物是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成,具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸
2、片段。,三、载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接,4、DNA接头连接法,接头的一端是齐平的,而另一端是某种内切酶的粘性末端,先利用齐平末端连接方法将它与平端的外源DNA连接起来,造成人工粘性末端,即可再与之互补的粘性末端的载体DNA相连接。,所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配,指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不相同,因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。,1、按照平末端连接方法加上接头。,2、将凹端变为平端,(1)使用Klenow酶在4种dNTP存在下,将3凹端完全补平。,(2)用S1核酸酶去除3突出末端产生平端DNA分子,3、使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平
3、3凹端转变成粘端。,TCGA,AGCT,GATC,CTAG,载体经xhoI酶切形成:,外源基因用San3A酶切形成:,用Klenow酶部分补平二者的3 凹端,形成:,TCGA,AGCT,GATC,CTAG,CT,TC,AG,GA,这样,就可以实现有效重组。,3,3,3,3,5,5,5,5,四、cDNA与载体的连接,通过依次加入、连接合成的DNA接头进行cDNA克隆,第二节 重组DNA分子的筛选与鉴定,外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况:,(1),(2),(3),转化,E.coli,一、遗传检测法,(一)根据载体表型特征选择重组体分子,1、抗药性标记插入失活筛选法,例:pBR322,
4、如果外源基因插入到tetr基因内部,tetr抗性消失,表型为不抗四环素(tets)、而仍抗氨苄青霉素(ampr),这样的转化细胞在含有 amp的培养基仍可生长,但在含有四环素的培养基上不能再生长;反之,如果ampr基因由于外源基因插入其内部而失活,带有重组DNA分子的转化细胞在含有tet的培养基平板上生长,在含有 amp的培养基不能生长。,插入失活法筛选重组子,2、互补,例;pUC质粒,在LacZ的大肠杆菌中,在平板培养中,菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒,其上有LacZ,质粒和大肠杆菌DNA可实现互补,菌落呈蓝色。 如果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因,则LacZ基因受
5、到破坏,便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的-半乳糖苷酶,因此,菌落呈白色。,(二)根据插入序列的表型特征选择重组体,进入受体细胞的重组DNA分子中的外源基因如果在宿主细胞中能实现功能表达,产生出有功能活性的基因产物,那么鉴定此种重组体最简便的方法就是表型特征的直接选择法。,二、物理检测法,1、凝胶电泳检测法,2、R-环法,在临近双链DNA变性温度下和高浓度(70%)的甲酰胺溶液中,即所谓的R-环条件下,双链的DNA-RNA分子要比双链的DNA-DNA分子更为稳定。因此,将RNA和DNA的混合物置于这种条件下,RNA便会同双链DNA分子中与之互补的序列退火形成稳定的 DNA-RNA杂交分子,而
6、另一条DNA链则成为单链状态。这种由单链DNA分支和双链DNA-RNA分支形成的“泡状”体,叫做R-环结构。,三、核酸杂交检测法,例:原位杂交筛选重组体菌落(或噬菌斑),四、免疫化学检测法,免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达,在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白,即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种 。,转化菌落,影印平板,置于含氯仿饱合气体的容器,细菌裂解,抗原释放,覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜,形成抗原抗体复合物,将NC膜与I125标记的抗体温育,放射自显影,与母板对照,挑取所需的重组克隆,标
7、记抗体测定法的步骤:,用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因,五、DNA-蛋白质筛选法,六、转译筛选法,原理:,外源DNA,蛋白质,翻译,能与某一特定DNA序列结合,作为探针与克隆群体杂交,转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法,可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种方法。,1杂交抑制转译,要求:被研究的目的基因编码有丰富的mRNA 。,原理:,步骤:,转化菌落,提取重组DNA,与mRNA总杂交,形成DNA-RNA杂种分子,将总mRNA(包括DNA-RNA分子,提取出来,体外转译,蛋白电泳放射自显影 (1),总mRNA,体外转译,蛋白电泳放射自显影 (2),经对比,(1)比(2
8、)中少了一种蛋白质,找到一种转译作用被抑制了的mRNA,筛选出重组菌落(或噬菌斑),2、杂交选择转译,观察到在这种杂交选择的转译中,存在着一种特殊活跃的mRNA。,重组体库,提取DNA,固定在NC膜上,与mRNA或总RNA杂交,目的基因与对应的mRNA杂交,mRNA固定在NC膜上,将分离mRNA的进行体外转译,凝胶电泳或生物活性检测,找出单菌落重组体,第三节 基因转移方法,一、重组DNA导入大肠杆菌,(一)转化,将外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞的过程都叫转化。,为了有效地使细菌吸收外源的DNA分子,我们通常要对它们进行一些物理或化学的处理,处理后的细胞吸收外源DNA的能力大大提高,被称为感
9、受态细胞。,对于大肠杆菌细胞,一般采用50mmol/L的CaCl2溶液来制备感受态细胞。,(1)吸附阶段:完整的双链DNA分子吸附于感受态细胞表面。 (2)转入阶段:双链DNA分子解链,以单链形式进入细胞,而另一链则被降解。 (3)自身稳定阶段;外源质粒在细胞内又复制成双链环型DNA。 (4)表达阶段:即目的基因随质粒的复制子一起复制,并被转录、转译。,DNA分子转化的过程:,质粒DNA的大小及构型对转化效率的影响:,(1)大小 10Kb,转化效率很低 (2)构型 超螺旋环形线状,(二)转染,(2)噬菌体的体外包装,转染(transfection):是指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体
10、的重组DNA分子的过程。,(1)转导和转染的区别,转导(transduction):通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。 转染:噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。,体外包装:是指在体外模拟噬菌体DNA在受体细胞内的一系列特殊的包装反应过程,将重组噬菌体DNA分子包装成为成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。,噬菌体的体外包装的原理:,根据噬菌体DNA的体内包装途径,分别获得缺失D包装蛋白的噬菌体突变株和缺失E包装蛋白的噬菌体突变株。由于不具备完整的包装蛋白,这两种突变株均不能单独包装噬菌体DNA,但将两种突变株分别感染大肠杆菌,从中提取缺失蛋白D的包
11、装物(含E蛋白)和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白),两者混合后就能包装噬菌体DNA。,二、重组DNA导入植物细胞的方法,(一)载体介导的转化方法,1、共培养法(cocultivation),该方法是Marton等1979年以原生质体为受体建立起来的,随后经过一系列的改进,现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。该方法的主要原理是将受体与供体在一起培养,通过接触感染而发生转移,供体常用农杆菌、病毒载体等形式。,(1)原生质体共培养法,取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养,促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。,从烟草无菌苗中分离原生质体,并预培养24小时。 原生
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