DNS法分析蛋白质末端氨基酸.ppt
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1、DNS法分析蛋白质末端氨基酸,一、实验目的 学习用DNS法分析蛋白质及肽的N-末端,掌握聚酰胺薄膜层析法的实际操作。,二、原理 蛋白质N-末端氨基酸的2-氨基与荧光试剂DNS-Cl(二甲氨基萘磺酰氯)反应后得到Dansyl-蛋白质(二甲氨基萘-5磺氨酰蛋白),经酸水解,得到Dansyl-氨基酸和各种游离氨基酸。DNS-氨基酸在波长254nm或265nm的紫外光照射下发出强烈的黄绿色荧光,并易于进行色谱分离,用聚酰胺薄膜层析可测出含量仅为10-9-10-l0摩尔的DNS-氨基酸,比FDNB(2,4二硝基氟苯法)的灵敏度高100倍左右。 实验中所得的DNS-氨基酸比相应的FDNB法得到DNP-氨基
2、酸更稳定,且耐酸水解。,本实验的反应首先在碱性(pH9.5-10.5)条件下,使蛋白质或多肽的N-末端氨基酸与DNS-Cl结合,得到二甲基氨萘-5-磺酰蛋白(DNS-蛋白)。此DNS-蛋白在6moll,HCl中水解时,蛋白质中的肽键均发生断裂,得到游离的氨基酸,而N-末端的氨基酸形成DNS-氨基酸。对此DNS-氨基酸进行鉴定,即可确定蛋白质的N-末端氨基酸。 DNS-C1能与所有的氨基酸作用生成具有荧光的衍生物,这些衍生物都相当稳定,在5.7molL盐酸溶液中经105条件下水解22h,除DNS-色氨酸全部被破坏,DNS-脯氨酸、DNS-丝氨酸(35)、DNS-甘氨酸(18)及DNS-丙氨酸(7
3、0)也被破坏,但其他DNS-氨基酸没有任何损失。,本实验采用的聚酰胺薄膜层析是20世纪70年代后发展起来的一种层析技术。聚酰胺薄膜是将锦纶涂布于涤纶上制成的。锦纶是由己二酸和己二胺聚合成的。其中含有大量的酰胺基团。由于酰胺的-CO基及-NH2可与被分离组分形成氢键,因此可以吸收酸类、酚类、硝基及胺基化合物等。由于被分离物质与其形成氢键的能力不同,因此对各种物质吸附的强度亦不同。因此选择适当的溶剂,使被分离物质在膜表面与溶剂间的分配系数产生较大的差异,经过吸附与解吸附的层层过程,使被分离物质彼此分开。 与纸层析相比,聚酰胺薄膜层析在分析氨基酸衍生物时具有灵敏度高、分辨率强、速度快、操作方便等优点
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