天然产物化学第二章.ppt
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1、,第二章,天然产物的提取分离和结构鉴定,一、天然产物化学成分的预试验 基本原理是根据各成分极性的不同,先系统地分成几个不同部分,然后利用显色反应或沉淀反应,或结合纸色谱、薄板色谱,定性判断各部分中可能含有的化合物类型。 根据相似相溶的原理,极性大的成分在极性溶剂中溶解度大,极性小的成分则易溶于非极性溶剂。选择适当的溶剂,极性由小到大,或由大到小,可顺次将极性比较相近的成分分开。常用溶剂的极性次序为(由小到大): 石油醚环己烷苯氯仿(二氯甲烷)乙醚乙酸乙酯正丁醇丙醇、乙醇甲醇水含盐水,第一节 天然产物化学成分的预试方法,表2-1 溶剂和有效成分极性相似对照,天然药材粗粉,5-10g,5-10g,
2、5-10g,加水50-100ml 浸湿1h,10倍量95 EtOH回流1h,10倍石油醚 浸提0.5h,水提液,EtOH提取液,石油醚提取液,(检查单糖、多糖、鞣质、 皂苷、aa、多肽、蛋白质),(检查萜类、甾体、 油脂、挥发油),回收EtOH,浓缩液,甲份,乙份,EtOH溶解,醇溶液,HCl溶液 (检测生物碱),不溶物,EtOAc溶解,(检查鞣质、酚类、有机酸、 黄酮、蒽醌、甾体、三萜等),EtOAC溶液,5NaOH溶液振摇,碱水液 (检查有机酸、酚类),EtOAC液,EtOH溶解,浓缩物(检查萜类、内酯、强心甘),天然产物化学成分的预试验流程图,2-1,生物碱 常用碘化铋钾(Dragend
3、orff试剂),显棕黄色或橘红色沉淀。 黄酮 将乙醇液加镁粉,滴入浓盐酸后震荡在泡沫处呈桃红色,或与1%AlCl3乙醇溶液呈有色荧光。 皂苷、强心苷、甾体 在乙酐溶液中与浓硫酸反映后显各种红紫色,皂苷水溶液震荡时能产生大量泡沫。,定性试验可初步验证有无上述各类物质,氨基酸和肽 与茚三酮反应显蓝紫色。 蛋白质 双缩脲反应(NaOH +CuSO4)显紫红色 有机酸 与溴酚蓝反应呈黄色 酚类 与FeCl3显紫色、蓝色 糖和苷 与斐林试剂作用有砖红色Cu2O沉淀。,二、天然产物化学成分的系统分离,系统分离包括粗分阶段和细分阶段: 粗分阶段主要指大类物质的分离,如皂苷、 蛋白质等,也可指相似极性物质的分
4、离; 细分阶段称作组分分离。,植物原材料粉末,用乙醇溶液浸提数次, 合并浸液,减压浓缩,浸膏,用热水浸提,搅拌悬浮, 用石油醚抽提数次,水层(或混悬物),石油醚(或苯)抽提液 (亲脂部位),用氯仿抽提,水层(或混悬物),氯仿可溶物(弱极性部位),用EtOAc萃取5次,分层,水层 (或混悬物),乙酸乙酯可溶物 (中等极性部位),正丁醇萃取,水层(强极性部位),正丁醇层(中等偏大极性部位),Fig 2-2 天然产物化学成分的系统分离流程,此提取法操作程序较繁,且耗费溶剂和时间。 对无资料可循的中草药、菌类代谢产物,往往先采用这个方法确定有效成分,然后根据实践中的体会和有效成分的理化性质,再改进、简
5、化分离方法。,对于水提液,可采用离子交换树脂将它分为碱、酸和中性三部分,如下图23所示。,目的物为已知成分或已知化学结构类型,如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄素,或从植物中提取某类成分如总生物碱或总酸性成分时,工作程序比较简单。 一般宜先查阅有关资料,搜集比较该种或该类成分的各种提取方案,尤其是工业生产方法,再根据具体条件加以选用。提取天然产物的常用方法: (一)溶剂法 (二)水蒸气蒸馏法 (三)分馏法 (四)沉淀法 (五)盐析法 (六)透析法 (七)升华法,第二节 活性有效成分的提取,原理: 根据天然产物中各种成分的溶解性能,选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂,将所需成分从
6、药材组织中溶解出来的一种方法。 包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取、连续回流提取。 1)浸渍法以水或稀醇为溶剂,在常温或温热(6080)条件下。适于遇热易破坏及含多量淀粉、黏液质、树胶、果胶的植物。 2)渗漉法 以稀乙醇或酸水为溶剂,不断向药材中添加新鲜溶剂,使其渗过药材。适于遇热易破坏及含多量淀粉、黏液质、树胶、果胶的植物。 但费溶剂、费时。 3)煎煮法 以水为溶剂 对具有挥发性及遇热易破坏成分、对含多量淀粉、黏液质成分的药材不宜用。 4)回流提取 以有机溶剂加热回流。对遇热易破坏的成分有影响,费溶剂、操作麻烦。 5)连续回流提取 弥补回流提取的缺点。提取效率高,节省溶剂,但时间较长。,(
7、一)溶剂法,1.采用几种不同极性的溶剂分步提取 选择三四种不同极性的溶剂,由低极性到高极性分步进行提取,使各成分依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。 一般先采用极性低的、与水不相混溶的有机溶剂,如石油醚、苯、氯仿、乙醚等;这些溶剂的选择性能强,但有些有毒,易燃(氯仿除外),价格昂贵,对浸入植物组织的能力较弱; 再用能与水相溶的有机溶剂,如丙酮、乙醇、甲醇等,最后用水提取。 目前常用的两种系统为A、己烷乙醚甲醇水;B、己烷二氯甲烷甲醇水。在室温下一次提取,这样可使植物中非极性与极性化合物得到初步分离。,(一)溶剂法,2.单一溶剂提取 A水 常用的溶剂中,水为取之不尽、用之不竭的溶剂。水是
8、一种强极性溶剂,天然药物中亲水性的成分,如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及其苷类等都能被水溶出。 有时为了增加某些成分的溶解度,也常采用酸水或碱水作为提取溶剂。例如多数游离的生物碱是亲脂性化合物,不溶或难溶于水,但与酸结合成盐后,能够离子化,加强了极性,就变成了亲水的物质,不溶或难溶于有机溶剂,所以通常用酸水提取生物碱。 对于有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分,则常用碱水提取,可使成分易于溶出。,(一)溶剂法,水提取存在的问题也不少,主要有以下几点: 水提取易酶解苷类成分,且易霉坏变质。 某些含果胶、粘液质类成分的天然药物,其水提取液常常很
9、难过滤。 沸水提取时,天然药物中的淀粉可被糊化,而增加过滤的困难。故含淀粉量多的天然药物,不宜磨成细粉后加水煎煮。 天然药物水提取液中含有皂苷及粘液质类成分,在减压浓缩时,还会产生大量泡沫,造成浓缩的困难。通常在实验室中往往加少量的戊醇或辛醇来克服,或可在蒸馏器上装置一个气-液分离防溅球加以克服,工业上则常用薄膜浓缩装置。,B亲水性的有机溶剂 指与水能混溶的有机溶剂,如乙醇(酒精)、甲醇(木精)、丙酮等,以乙醇最常用。 乙醇的溶解性能比较好,对天然药物细胞的穿透能力较强。天然药物中除亲水性成分如蛋白质、粘液质、果胶、淀粉、部分多糖,油脂和蜡质等外,其余成分在乙醇中皆有一定程度的溶解度;一些难溶
10、于水的亲脂性成分在乙醇中的溶解度也较大。 而且乙醇的浓度还可以根据被提取物质的性质而变化,采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取时,乙醇的用量、提取时间皆比用水提取节省,溶解出来的水溶性杂质也少。 乙醇为有机溶剂,虽易燃,但毒性小,价格便宜,来源方便,有一定设备即可回收反复使用,而且乙醇的提取液不易发霉变质。 因此乙醇是实验室和工业生产中应用范围最广的一种溶剂,是历来提取最常用的一种溶剂。甲醇的性质虽和乙醇相似,沸点也比较低(64),但因为有毒性,所以提取时少用,使用时应注意安全。,(一)溶剂法,C亲脂性的有机溶剂 与水不能互溶的有机溶剂,如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等。这些溶
11、剂的选择性强,不能或不容易提出亲水性杂质,易提取亲脂性的物质,如油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素等强亲脂性的成分。 这类溶剂容易挥发,多易燃(氯仿除外),一般有毒,价格较贵,设备要求也比较高,操作需要有通风设备。 另外这类试剂透入植物组织的能力较弱,往往需要长时间反复提取才能提取完全。 药材中水分的存在,会降低这类溶剂的穿透力,很难浸出其有效成分,影响提取效率,所以对原料的干燥度要求较高。 鉴于以上原因,在大量提取中草药原料时,或工业生产时直接应用这类溶剂有一定的局限性。,(一)溶剂法,D 酸性、碱性有机溶剂 如果有效成分是酸性或碱性化合物,常可加入适当的酸或碱,再用有机溶剂提取。 例如生物碱在植
12、物体中一般与酸结合成盐存在,在生药中加入适量的碱液,拌匀,使生物碱游离出来,再用有机溶剂(如苯、氯仿)提取。同样,有机酸可加酸使其游离,然后用有机溶剂提取。 提取可以在室温下进行,亦可用蒸气浴加热提取,一般来说,冷提杂质较少,而热提效率较高,但杂质较多。 在不了解有效成分的情况下,一般采用冷渗或室温浸渍,提取液在60以下浓缩,如溶剂沸点超过70则采用减压蒸馏浓缩,若有固体或结晶,可滤出,与母液分开后再进一步分离纯化其中的成分。 在提取分离过程中,应该注意,复杂的混合物在各成分之间具有助溶的作用,经提纯后往往难溶或不溶于原来的提取溶剂中。,(一)溶剂法,3.两种或两种以上溶剂 利用植物中所含成分
13、在某种溶剂中溶解度的差异而达到分离的目的。,(一)溶剂法,4.液-液分配萃取 原理:利用混合物中的各成分在两种互不相溶的溶剂中,由于分配系数不同而达到分离的目的。分配系数在一定温度及压力下为一常数,可用下式表示:K=Cu/CL Cu:表示溶质在上相溶剂中的浓度; CL:表示溶质在下相溶剂中的浓度。 萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大,则分离效率越高; 若所需成分是脂溶性,可用有机溶剂如苯、氯仿或乙醚与水进行液液萃取,可除去水溶性物质糖类、无机盐等; 若所需成分是亲水性物质,其水溶液用弱亲脂性溶剂,如乙酸乙酯、丁醇、戊醇等萃取。有时可在氯仿或二氯甲烷中加少量甲醇或乙醇进行萃取。,(一)
14、溶剂法,5.反应溶剂萃取 通常内酯类化合物不溶于水,其内酯环遇碱水解成为羧酸盐而溶于水,再加酸酸化,可重新形成内酯环,回复原物而不溶于水,从而与其它杂质分开。 从蛔蒿中提取驱蛔有效成分山道年就利用此性质。,(一)溶剂法,适于具有挥发性,能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分的提取。 这些化合物与水不相混溶或仅微溶,且在约100时有一定的蒸气压,当水蒸气加热沸腾时,能将该物质一并随水蒸气带出。 例:大蒜素(allicin)的提取 大蒜用酒精浸泡,酒精提取液减压蒸去大部分酒精后,剩余液加水稀释,继续减压蒸馏,这时大蒜素随水一起蒸出,蒸出液用乙醚抽提,醚液浓缩干,即得油状的大蒜素。,(二)水蒸气蒸馏法,
15、水蒸气蒸馏装置,分馏就是多次蒸馏。 利用分馏技术甚至可以将沸点相距12的混合物分离开来。 例:在分离毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱时,可利用它们的沸点不同进行常压或减压分馏,然后再精制纯化。,(三)分馏法,原理:利用某些植物成分与某些试剂产生沉淀的性质而得到分离或除去“杂质”的方法即为沉淀法。 最常用铅盐法中性乙酸铅或碱式乙酸铅,在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐或鉻盐沉淀。 脱铅方法通常用硫化氢气体,使分解并转为不溶性硫化铅沉淀而除去。 通入空气或CO2让气泡带出多余的硫化氢气体,(四)沉淀法,脱铅的方法也可使用硫酸、磷酸、硫酸钠等物质,但生成的硫酸铅及磷酸铅在水中有一定的溶解度,
16、所以脱铅不彻底; 由于方法比较简便,故实验室中仍常采用阳离子交换树脂,虽可脱铅,但植物中离子性化合物也同时被交换而损失,并促使离子交换树脂老化,因此不常采用。,表22 几种实验室常用的沉淀剂,油茶饼乙醇提取减压蒸馏浓缩残渣加乙醚脱脂不溶物再溶于乙醇中加乙醚使皂苷析出沉淀物溶于乙醇,加胆固醇沉淀,过滤沉淀干燥后置于索氏抽提器中用苯回流不溶物为皂苷,苯液浓缩后可回收胆固醇。 此皂苷对麦胚芽的生长具有明显的抑制作用。,例如:油茶皂苷的提取,一般来说,所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出,这一过程叫盐析。 常用的沉淀剂有NaCl、NH4Cl、(NH4)2SO4、Na2SO4、 MgSO4等。
17、 例如,三颗针根粉用稀酸浸泡,稀酸液加NaCl近饱和即析出小檗碱盐酸盐。,(五)盐析法,(六)透析法,透析是利用具有特定大小、均匀孔径的透析膜或超滤膜 的筛分机理,在不加压或加压的条件下,水和小分子物质 选择性通过半透膜,酶、蛋白质等大分子物质则被截留而 达到分离的方法。 常用于纯化皂苷、蛋白质、多肽和多糖等化合物。 透析成功与否与膜孔的大小密切相关,根据欲分离成份 分子的大小选择适当规格的透析膜,常用的有动物膜(如猪 牛的膀胱)、火棉胶膜、蛋白质胶膜和玻璃纸膜等。,市场有透析膜管出售,举例如下: 天花粉蛋白质的分离:天花粉是葫芦科植物栝楼的新鲜根,刨去麦皮,压汁放置过夜后离心除去沉淀,上清液
18、加硫酸铵分级沉淀,饱和度分别为40%、50%及75%,最后所得蛋白质沉淀,加水溶解置于半透膜袋中进行透析,透析液无硫酸根反应为止,将袋内液体冷冻干燥即得。,固体物质受热直接气化,遇冷后又凝固为固体化合物,称为升华。 例如樟木中的樟脑 、茶叶中的咖啡因具有升华特性。,(七)升华法,一、根据物质溶解度差别进行分离 二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离 四、根据物质分子大小进行分离 五、根据物质解离程度不同进行分离 六、其他分离方法,第三节 天然产物的分离和精制,1. 利用温度不同可引起物质溶解度的改变的性质 以分离物质,如常见的结晶和重结晶。 (1)结晶
19、的条件 过饱和溶液,适合的温度5-10,静置。 (2)结晶溶剂的选择 溶剂能对所需成分的溶解度随温度的不同而有 明显的差别,即热时溶解,冷时析出。对杂质 来说,在该溶剂中应不溶或难溶。 常用的结晶溶剂有CH3OH 、EtOH、Acetone 和EtOAc等。,一、根据物质溶解度差别进行分离,结晶形成过程包括晶核的形成与结晶的生长两部分。 选择适当的溶剂是形成晶核的关键。 加晶种是诱导晶核形成的有效手段。 (4)不易结晶或非晶体化合物的处理 化合物不易结晶,原因一是本身的性质所决定的。二是由于夹杂不纯物质引起的。 若是化合物本身的性质,需要制备其结晶性的衍生物或盐。 常用的有盐酸盐、氢溴酸盐、氢
20、碘酸盐、过氯酸盐和苦味酸盐等。,(3)制备结晶的方法,每种化合物的结晶都有一定的形状、色泽和 熔点,可以作为初步鉴定的依据。 纯化合物结晶的熔点熔距应在 1-2内。 经典方法判断化合物的纯度是比较复结晶前 后结晶的形状和熔点。 结晶的形状很多,常见为针状、柱状、棱柱 状、板状、片状、方晶、粒状、簇状及多边形棱 柱状晶体等。,(5)结晶纯度的判断,2. 在溶液中加入另一种溶剂以改变混合剂的极性,使一部分物质沉淀析出,从而实现分离。 例如: 在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇,以沉淀除去糖类、蛋白质等水溶性杂质(水提醇沉法); 或在浓缩乙醇提取液中加入数倍量水稀释,放置使沉淀而除去树脂、叶绿
21、素等水不溶性杂质(醇提水沉法)。,3. 酸性、碱性或两性有机化合物,可加入酸、碱以调节溶液的pH值,改变分子的存在状态(游离型或解离型),从而改变溶解度而实现分离。 例如: 一些生物碱类用酸水从药材中提出后,加碱调至碱性即可从水中沉淀析出(酸提碱沉法)。,4. 酸性或碱性化合物可以通过加入某种沉淀试剂使之生成不溶于水的盐类沉淀析出。 例如: 酸性化合物可生成钙盐、钡盐等,碱性化合物如生物碱等可生成苦味酸盐、苦酮酸盐等有机酸盐或磷钼酸盐、磷钨酸盐等。,一、根据物质溶解度差别进行分离 二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离 四、根据物质分子大小进行分离 五
22、、根据物质解离程度不同进行分离 六、其他分离方法,第三节 天然产物的分离和精制,1. 液-液萃取法 2. 纸层析 3. 液-液分配柱色谱 4. 分配薄层色谱法,二、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,(1)分配系数K值 两种不能互溶的溶剂(如石油醚与水)置于分液漏斗中进行充分振摇,放置后即可分成两相。此时其中含有的溶质在两相溶剂中的分配比在一定温度及压力下为一常数。 可用下式表示: K=Cu/CL Cu:表示溶质在上相溶剂中的浓度; CL:表示溶质在下相溶剂中的浓度。,1.液-液萃取,例如:现在假定有A、B两种溶质用氯仿和水进行分配,A、B均为1g,KA =10,KB=0.1,两相溶剂体
23、积比V氯仿/V水=1,q请问用分液漏斗需做几次分配可基本上实现分离? 解:第一次振荡分配平衡后, KA C水/ C氯仿10,由于V氯仿 V水,CV=m 所以mA水/ mA氯仿10,即mA水10 mA氯仿 一次振荡分配平衡后,溶质A90%以上将分配在上相溶剂(水)中,不到10%则分配到下相溶剂(氯仿)中。 同理,由于KB=0.1,所以振荡分配平衡后,溶质B的分配将与A相反。不到10%留在水中,90%以上分配在氯仿中 。 在上述条件下,A、B两种溶质在氯仿和水中仅作一次分配就可实现90%以上程度的分离。,用分离因子值来表示分离的难易。 分离因子定义: A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数 的比值
24、。即:=KA/KB(注:KAKB) 100,作一次简单萃取就可实现基本分离; 10010,则需萃取10-12次; 2时,需做100次以上萃取; 1时,KAKB,作任意次分配也无法实 现分离。,(2)分离难易与分离因子,对酸性、碱性及两性有机化合物来说,pH值变化可以改变它们的存在状态(游离态或解离型),从而影响在溶剂系统中的分配比。 以酸性物质为例,其在水中的解离平衡及解离常数K,可用下式表示: HA + H2OA- + H3O+ 当pH值3时,酸性物质多呈非解离状态(HA)、碱性物质则呈解离状态(BH+)存在; 当pH值12,则酸性物质呈解离状态(A-)、碱性物质则呈非解离状态(B)存在。,
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