实时荧光定量PCR实验结果分析.ppt
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1、实时荧光定量PCR实验结果分析,邓椋爻 技术支持 广州市昊洋贸易有限公司,定量分析 绝对定量 相对定量,定量PCR应用,定性分析 SNP分析,基因扫描 阴阳性判定 熔解曲线分析,绝对定量:How Many 优点:给出目标基因初始模板的绝对数量,数据容易处理 缺点:必须有标准品,做标准曲线 应用:病毒拷贝数;转基因的拷贝数;转基因成分百分含量检测,绝对定量与相对定量,相对定量:How Much 优点:需要/不需要标准品;使用广泛 缺点:数据理解困难 应用:差异表达分析;芯片评估,14500 copies,108,106,102,104,绝对定量,108,106,102,104,绝对定量,绝对定量
2、,108,106,102,104,绝对定量,105 copies/well,绝对定量,1/3,Blank,1/3,1/3,1/3,1.11 ng/2ul,0.37 ng/2ul,0.12 ng/2ul,10.0 ng/2ul,3.33 ng/2ul,相对定量,Control CT = 21.3 Sample A CT = 22.8 Sample B CT = 19.3,相对定量,Control CT = 21.3 = 1.5ng / tube 1 Sample A CT = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33 Sample B CT = 19.3 = 6.0ng / tube 4
3、,Fold,相对定量,相对定量数据处理,管家基因校准(Normalization Gene) 得出每个细胞中的目的基因 目标基因vs. 管家基因 对照样品校准(Calibrator Sample) 得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample. 处理的vs. 未处理的,6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常.,按比例稀释标准品,根据标准曲线确定样本初始模板浓度 至少需要两个标准曲线 GOI reference gene 标准曲线确定反应扩增效率,相对定量标准曲线,相对定量,相对定量:CT法,依据:平均相对含量% = 2 平均CT 数据处理: C(t)GOI- C(t)ref= C
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