实验-8-原生质体游离与体细胞融合.ppt
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1、植物组织培养实验技术,北京林业大学 2015-5,实验八 原生质体游离与体细胞融合,一 实验目的,通过观察落从叶肉分离出的原生质体,了解植物原生质体分离和体细胞杂交的基本方法。,二 实验内容,原生质体的分离 原生质体来源:叶片、愈伤、细胞悬浮培养物 分离原生质体:机械法、酶解法 影响因子:前处理、酶处理、渗透压 原生质体净化:过滤、沉降法、漂浮法、界面法,2. 原生质体的融合 自发融合 诱导融合: NaNO3处理 高pH/高浓度钙处理 PEG处理 电融合,融合前,融合中,聚乙二醇(PEG)介导的体细胞融合,PEG带微弱极性的负电荷,能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。当P
2、EG分子链足够大时,在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用,引起原生质体紧紧粘连成团。Ca2+在蛋白质或磷脂负电荷基团和PEG之间形成桥梁,加强原生质体之间的粘连作用。在洗涤过程中,直接或间接与质膜结合的PEG分子从原生质体表面洗脱,并随着pH值的降低,导致膜电荷的不平衡和发生重新分布。质膜紧密接触区域的电荷重新分布使一个原生质体的某些正电荷基团与另一个原生质体的负电荷基团联结,反之亦然,最后导致原生质体发生融合。融合细胞在培养过程中再生细胞壁、分裂生长形成愈伤组织和再生植株,产生体细胞杂种植株。,三 仪器、材料和试剂,1.仪器: 离心机、摇床、分析天平、pH计、80m细胞筛、镊子、烧杯、胶头
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