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1、实验三,质粒提取与电泳,【实验目的】,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法。,【实验原理】,碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH值4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此,复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此己完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过
2、离心,染色体DNA分子与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,【仪器、材料与试剂】,(一) 仪器 1.恒温培养箱 2.恒温摇床 3.台式离心机 4.高压灭菌锅 5.电泳仪、电泳槽 6.分光光度仪 7.凝胶成像系统,(二) 材料 1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷(Tris) 3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.氯仿,9. 乙醇 10胰RNA酶 11氨苄青霉素 12蔗糖 13溴酚蓝 14酚 15. 含pUC19质粒的大肠杆菌 16吸头、小指管,(三) 试剂 1. 溶液I 50 mmol/L 葡萄糖 25
3、 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)TrisHCl (pH8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) (pH8.0) 2. 溶液II 0.4 mol/L NaOH, 2% SDS, 用前等体积混合 3. 溶液III 5mol/L 乙酸钾 60 mL 冰乙酸 11.5 mL 水 28.5 mL,4. TE缓冲液 10 mmoL/L TrisHCl (pH8.0) 1 mmoL/L EDTA (pH8.0) 5. 70%乙醇 (放-20冰箱中,用后即放回) 6. 胰RNA酶 将RNA酶溶于10mmoL/L TrisHCl(pH7.5)、15mmoL/L NaCl中, 配成10m
4、g/mL的浓度, 于100加热15min, 缓 慢冷却至室温,保存于-20。 7. 凝胶加样缓冲液(6X):40%蔗糖、0.25%溴酚兰。,【实验步骤】,1. 将2 ml含相应抗生素(Amp:50g/mL)的LB液体培养基加入到试管中,接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌,37振荡培养过夜。 2. 取1.5 mL培养物倒入微量离心管中,4000 r/min离心2min。 3. 吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。 4. 将细菌沉淀悬浮于100L溶液中 (此处可加5L 浓度为10g/L RNase A处理RNA,在后面TE中就不必加RNase A), 充分混匀,室温放置10 min。,5. 加20
5、0L溶液(新鲜配制),盖紧管盖,混匀内溶物,将离心管放冰上5 min。 6. 加入150L溶液(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置15 min。 7. 12000 r/min离心15min,将上清转至另一离心管中。 8. 向上清中加入等体积酚:氯仿(1:1)或氯仿:异戊醇(24:1)(去蛋白),反复混匀,12000 r/min离心5 min,将上清转移到另一离心管中。,9. 向上清中加入2倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置510 min。12000 r/min离心5 min。倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 10. 用1 mL 70乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。 11. 加50L TE缓冲液,(其中含有20g/mL的胰RNA酶),使DNA完全溶解,-20保存。 12. 紫外分光光度计测定DNA样品浓度(1L DNA + 49L H2O)。 13. 电泳检测DNA样品(1-2L DNA + 1L loading buffer + 3-4L H2O),【实验结果】,1. 根据测定的样品在260 的OD值,计算样品DNA浓度, 2. 在紫外光下观察到在凝胶上约2.7 kb处有条带,即pUC19质粒。,【实验安排】,本实验在一天内完成。,
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