实验二 DNA的酶切、电泳与Southern杂交.ppt
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1、实验二 DNA的酶切、电泳 与Southern杂交,实验目的,学习并掌握DNA酶切、电泳技术 学习掌握Southern杂交的原理和技术,实验原理,限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类: 类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。 类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。 类中的限制性内切酶
2、在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。,类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。 绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3),有少数酶识别更长的序列或简并序列。 类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3);有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端,如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。,5,5,Alu I,5,AG,TC p,CT,GA,5 p,AGCT,TCGA,酶切后平末端
3、,酶切后粘性末端,DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。 大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。 如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70低温冰箱30分钟,离心
4、、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。,酶切过程中的注意事项,在酶切过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般DNA用量约为0.5-1g。 限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37)。 对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。,酶切过程中的注意事项,DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱
5、绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的限制性片段长度多态性(RFLP)技术更是建立在它的基础之上。,技术应用,DNA限制性内切酶酶切图谱,目标DNA片段分析,基因工程中外源DNA与载体的连接,目标DNA片段分析,基因工程中外源DNA与载体的连接,DNA限制性内切酶酶切图谱,Southern杂交,建立酶切反应体系,适量DNA 2ul 10x限制性内切酶缓冲液 2ul 40 mmol/L spermidine 1ul 100 mmol/L DTT 限制性内切酶 2/ug DNA 加ddH2O定容至20ul 注意:酶、缓冲液等需置于冰
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