实验四.福林—酚试剂法测定血清总蛋白.ppt
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1、实 验 四 福林酚试剂法测定血清总蛋白,学习测定蛋白质浓度的测定方法 学习绘制标准曲线及用标准曲线求待测物质含量的方法,实验目的,蛋白质浓度测定,双缩脲法 微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外吸收法,实验原理,双缩脲反应: 在碱性条件下,双缩脲可与铜离子结合生成紫红色化合物。,双缩脲法测定蛋白质,H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3,双缩脲,具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应,颜色深浅与其浓度成正比,可用比色法进行测定。,本法操作简单,重复性好,干扰物质少。但缺点是灵敏度较低 测定蛋白质范围为1-10mg,微量凯氏定氮法,含氮
2、化合物与浓硫酸共热分解产生氨,氨与硫酸反应生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下分解生成氨;用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中,然后再用标准酸溶液进行滴定,所用无机酸的量相当于被测样品中氨的量,从而可计算样品的含氮量。 蛋白质含氮量通常在16 %左右,将测得的含氮量乘上6.25,便得到该样品的蛋白质含量。,Folin酚试剂法(Lowry法),Step 1,碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物,蛋白质铜复合物使磷钨酸磷钼酸还原,蛋白质中含有酚基的酪氨酸,可使酚试剂中的磷钨酸 磷钼酸还原而呈蓝色,显色反应(蓝色)。在一定条件下,蓝色强度(A660) 与蛋白质的量成正比例,Step 2,优 点:,缺
3、点:,操作简便灵敏度高,有蛋白质特异性的影响; 受多种因素干扰,可检测的最低蛋白质量达5 g/ml,通常测定范围是25-250 g/ml,干扰物质,蔗糖,Tris缓冲液,硫酸胺,酚类,尿素,柠檬酸,胍,硫酸钠,三氯乙酸,乙醇,丙酮,CHAPS,EDTA,EGTA,HEPES,Triton X-100,dithiothreitol,实验器材与试剂,大试管、刻度吸量管、恒温水浴箱,722E型分光光度计,试剂甲,试剂乙,标准蛋白溶液(250g/ml),待测血清(稀释500倍),取7支洁净试管,按下表加入试剂,实验步骤,混匀后室温放置20分钟,在各试管中分别加入试剂乙0.3mL,30分钟后以空白管为对
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