交叉保护防治柑橘衰退病研究进展.pdf
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1、园 艺 学 报 2014,41(9) :17931801 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: 收稿日期:收稿日期:20140623;修回日期:修回日期:20140902 基金项目:基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(201203076-01) ;重庆市自然科学基金项目(CSTC2012jjA80029) ;重庆市应用开发计 划项目 (CSTC2014yykfA8005) ; 柑橘学重庆市市级重点实验室开放基金项目 (CKLC201101) ; 中央高校基本科研业务费项目 (XDJK2014C027, XD
2、JK2014A001) * E-mail: 交叉保护防治柑橘衰退病研究进展 周 彦* (西南大学柑橘研究所国家柑橘工程技术研究中心,重庆 400712) 摘 要:摘 要:柑橘衰退病毒引起的茎陷点型和速衰型衰退病对世界柑橘产业造成了严重损失。目前交叉 保护是防治茎陷点型衰退病最有效的方法,也用于酸橙砧木速衰型衰退病的防治。从各国防治经验、弱 毒株筛选方法、防治机理等方面对交叉保护防治柑橘衰退病的最新研究进展作出综述,同时就现有交叉 保护防治技术的不足和解决途径进行讨论和展望,旨在为更好地防治柑橘衰退病提供借鉴。 关键词:关键词:柑橘衰退病;交叉保护;弱毒株筛选;研究进展 中图分类号:中图分类号:
3、S 666 文献标志码: 文献标志码:A 文章编号: 文章编号:0513-353X(2014)09-1793-09 Progresses in Study of Cross Protection Against Citrus tristeza virus ZHOU Yan * (National Citrus Engineering Research Center,Citrus Research Institute,Southwest University,Chongqing 400712, China) Abstract:Citrus tristeza virus(CTV)causes st
4、em pitting and quick decline that have caused devastating losses in global citrus production. At present,the best means to protect commercial citrus against endemic stem pitting isolates of CTV has been cross-protection with appropriate mild CTV isolates. Research was directed towards the selection
5、and screening of mild strains of CTV which could protect against sour orange decline strains. In this paper,progress in cross protection against CTV,the screening of mild strains of CTV and the mechanism of cross protection were reviewed. Furthermore,the possible disadvantages for using cross protec
6、tion against CTV were also discussed in order to lay a sound foundation for better control of the damage caused by CTV. Key words:Citrus tristeza virus;cross protection;screening of mild strains;research advance 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的茎陷点型和速衰型衰退病是世界性柑橘病害, 已毁灭了超过 1 亿株柑橘,并仍然严重威胁着世界上以酸橙作砧木
7、的柑橘和对茎陷点型衰退病敏感 的柚类、葡萄柚和某些甜橙的安全(Muniz et al.,2014)。中国广泛分布着 CTV 的各种强毒株和强 力媒介褐色橘蚜(Toxoptera citricida),但由于历史上长期使用抗病/耐病砧木,并主要种植耐病的 宽皮柑橘,因此以往生产上没有出现显著危害(赵学源 等,1979;Ke et al.,1984)。随着 20 世纪 80 年代后期中国进行柑橘产业结构调整,茎陷点型衰退病在柚类、甜橙和杂柑等敏感品种上的为害 1794 园 艺 学 报 41 卷 变得日益严重(Zhou et al.,1996;周彦 等,2008)。由于 CTV 在田间以蚜虫传播为主
8、,且蚜虫发 生世代多、传毒率高,因此通过使用无病毒苗木或防治蚜虫来防治柑橘衰退病效果不明显。目前的 研究证明,运用交叉保护技术,即在无病毒柑橘上预免疫接种有保护作用的弱毒株,是防治茎陷点 型衰退病最有效的方法。此外,为延长酸橙砧木的使用寿命,交叉保护也用于酸橙砧木上速衰型衰 退病的防治研究。关于交叉保护技术防治柑橘衰退病的综述文章较少(Moreno et al.,2008; Folimonova,2013;傅翠娜 等,2013;Lee & Keremane,2013),其内容主要集中于弱毒株筛选、 田间监控以及防效评估等。本文中对交叉保护防治柑橘衰退病的作用机理、存在的问题和解决途径 进一步综
9、述,突出了该研究领域的最新研究进展,并对中国的相关研究进行了总结,旨在为更好地 防治柑橘衰退病提供借鉴。 1 柑橘衰退病的类型 CTV 为长线型病毒属(Closterovirus)成员,能感染绝大多数柑橘种、杂种及近缘种,主要通 过蚜虫和带毒苗木(接穗)传播(Broadbent et al.,1996) 。CTV 存在复杂的株系分化现象,主要引 起 3 种类型的衰退病。 (1)茎陷点型衰退病:与砧木品种无关,引起莱檬、葡萄柚和某些甜橙、柚 类、杂柑上的茎陷点症状,造成果实品质降低,产量减少,失去经济价值。(2)速衰型衰退病:引 起以酸橙作砧木的植株树势衰退,直至死亡。 (3)苗黄型衰退病:主要
10、引起酸橙、 尤力克柠檬、 葡萄柚和柚的幼龄实生苗的黄化、矮缩(Bar-Joseph et al.,1989;Garnsey et al.,1991)。 2 弱毒株筛选方法 2.1 指示植物鉴定和血清学检测 弱毒株筛选是交叉保护的关键。传统的方法是通过指示植物鉴定和血清学检测。 指示植物鉴定虽然鉴定周期较长, 且需要一定的隔离条件, 但目前仍是 CTV 弱毒株筛选的重要 手段。在鉴定 CTV 的致病力时常同时使用摩洛哥酸橙、 赛蒙斯甜橙、 邓肯葡萄柚、 墨 西哥 来檬, 以及用酸橙作砧木的甜橙等 5 种指示植物 (Garnsey et al., 1991; Broadbent et al., 1
11、996) 。 目前有 50 余种单克隆抗体被用于 CTV 株系鉴定研究,其中单克隆抗体 MCA13 因可特异性识 别速衰型 CTV 在衣壳蛋白第 124 位点氨基酸发生的变异,因此被广泛应用于速衰型 CTV 的检测 (Pappu et al.,1993;Wu et al.,2014)。此外,近年来还有多个单克隆抗体被尝试用于鉴定茎陷点 型 CTV(Peroni et al.,2009;Wu et al.,2014)。 2.2 RFLP 分析 Gillings 等(1993)根据 CTVp25 基因经限制性内切酶 Hinf酶切后产生的谱型差异将 CTV 分 为了 7 个组群, 其中组群 4 和组
12、群 5 的分离株与弱毒系相关联, 其它组群的分离株与强毒系相关联。 在此基础上,Corazza 等(2012)使用限制性内切酶 Rsa和 Hinf对 p25 基因进行双酶切,从而将 CTV 进一步分为 12 个组群,提高了该方法对 CTV 强弱株系的识别能力。 2.3 特异性 RT-PCR 及相关技术 根据 CTV 在 5末端非编码区(UTR) 、k17、POL 区域,以及 p23、p25 基因的序列差异建立的 特异性 RT-PCR 检测体系可快速区分 CTV 的强弱毒株 (Sambade et al., 2003; Hilf et al., 2005; Matos et al.,2013)
13、。近年来,随着实时 PCR 技术的发展,分别以 SYBR green和 TaqMAN 探针为基础建 9 期 周 彦:交叉保护防治柑橘衰退病研究进展 1795 立的特异性实时 RT-PCR 检测体系也已运用于 CTV 强弱毒株的鉴定(Ruiz-Ruiz et al.,2009; Ananthakrishnan et al.,2010;Yokomi et al.,2010),监测预免疫植株中强弱毒株含量的时空变化规 律(邹勤 等,2011)。 3 茎陷点型衰退病的防治 3.1 巴西茎陷点型衰退病防治进展 从 20 世纪 50 年代起, 研究人员就开始尝试运用交叉保护技术防治酸莱檬上的茎陷点型衰退病
14、, 但所有预免疫植株在田间生长 5 年后都陆续表现出严重的茎陷点症状(Balaraman & Ramakrishnan, 1980) 。20 世纪 60 年代,巴西最重要的柑橘品种佩拉甜橙上爆发了极其严重的茎陷点型衰退病。 为挽救巴西柑橘产业,研究人员从重病果园中幸存的且不表现明显症状的佩拉甜橙、 Galego 莱檬,以及葡萄柚中筛选出 100 余个 CTV 弱毒株,根据网室拮抗接种试验的筛选结果,从中选取了 13 个分别来自佩拉甜橙和Galego莱檬,且具有较好保护效果的 CTV 弱毒株开展田间防治 试验,经过多年的田间防效评价,最终获得了对莱檬和甜橙茎陷点型衰退病具有显著持久防治效果 的
15、CTV 弱毒株#66, 该弱毒株的大规模使用, 拯救了濒临崩溃的巴西柑橘产业 (Mller & Costa, 1968; Costa & Mller,1980;Mller et al.,1988,2000) 。随后又陆续从Galego莱檬上获得了多个用 于防治茎陷点型衰退病的 CTV 弱毒株(Mller et al.,2000) 。如今巴西所有的佩拉甜橙都必须 预免疫接种 CTV 弱毒株,共计已有 800 余万株佩拉甜橙采用了该技术,这些预免疫植株在田间 生长 40 年后仍未感染茎陷点型衰退病强毒株(Zanutto et al.,2013) 。此外,巴西多年来还一直运用 单链构象多态性(SSC
16、P) 、RFLP 和序列分析等方法对田间使用 CTV 弱毒株的稳定性、防治效果, 以及可能出现的外来强毒株进行监控,同时不断筛选新的弱毒株用于防治茎陷点型衰退病(Costa et al.,2010;Zanutto et al.,2013)。 3.2 南非茎陷点型衰退病防治进展 20 世纪 40 年代, 南非数百万株葡萄柚和莱檬因感染茎陷点型衰退病造成品质和产量急剧下降, 大量植株失去经济价值(van Vuuren et al.,1993)。为此,从 70 年代起,南非开始进行交叉保护防 治茎陷点型衰退病的研究。von Broembsen 和 da Graa(1988)从田间筛选出 50 余个
17、CTV 弱毒株, 并在网室中通过棉蚜(Aphis gossypii)拮抗接种强毒株的方式,最终获得了 3 个具有显著保护效果 的弱毒株。其中来源于墨西哥莱檬的 CTV 弱毒株 LMS6 可用于保护莱檬和甜橙,来源于葡萄 柚的弱毒株 GFMS35 和 GFMS12 均能保护葡萄柚,且 GFMS12 的保护能力更强(van Vuuren et al., 1993;Luttig et al.,2002)。弱毒株 GFMS12 在田间使用 30 多年后,对马叙葡萄柚仍具有较好 的保护效果(Scott et al.,2013)。 3.3 中国茎陷点型衰退病防治进展 作者所在实验室从 20 世纪 70 年
18、代开始利用指示植物对中国 CTV 的构成进行鉴定 (赵学源 等, 1979)。近年来通过综合运用 p25/HinfRFLP 组群分析、SSCP 分析、p23/BD-PCR、多重分子标记 和基因序列分析等方法,对采自中国各柑橘主产区的 3 000 余份 CTV 分离株进行了初筛,结合指示 植物鉴定, 从中获得了 50 余个 CTV 弱毒株, 然后采用单蚜传毒的方式对其进行分离纯化 (周彦 等, 2005a,2005b;宋震 等,2006;Zhou et al.,2007) ,并在此基础上开展褐色橘蚜接种强毒株的拮抗 试验,初步筛选出了 8 个具有潜在保护效果的弱毒株(周彦 等,2008) 。目前
19、本实验室针对纽荷 尔脐橙、 北碚447甜橙、 琯溪蜜柚、 不知火等优良柑橘品种,在重庆多地开展了田间 1796 园 艺 学 报 41 卷 防效试验。此外,也有研究人员通过指示植物鉴定、p23/BD-PCR 和 RFLP 分析等方法从田间筛选 出少量弱毒株, 并在 本地早 和 墨西哥 莱檬上进行了接种强毒株的拮抗试验 (崔伯法 等, 2005; Jiang et al.,2008;李芳 等,2010)。 3.4 其它国家茎陷点型衰退病防治进展 除在重病果园中幸存的健康植株上获得弱毒株外,在秘鲁等国还通过棉蚜将苗黄型或茎陷点型 CTV 强毒株经西番莲(Passiflora),再传回墨西哥莱檬的方式
20、来降低强毒株的致病力。通过这 种方法,Roistacher 等(1988)和 Bederski 等(2005,2010)获得了多个弱毒株,其中 Code 37A 对 福本脐橙、卡拉卡拉脐橙、晚棱脐橙和奈维林娜脐橙均有很好的保护效果;Code 37B 对马叙葡萄柚的保护效果极佳;Code 37C 可保护星路比葡萄柚、 马叙葡萄柚、 火 焰葡萄柚和奥朗布朗克葡萄柚。此外,澳大利亚、日本等国也已成功运用交叉保护技术防治 本国的茎陷点型衰退病(Broadbent et al.,1991;Ieki et al.,1997;Zhou,2001;Zhou et al.,2002)。 4 速衰型衰退病的防治
21、虽然使用枳、枳橙等抗病品种作为砧木可有效防治速衰型衰退病的危害,但由于酸橙砧木具有 土壤适应性强、嫁接亲和性高、抗脚腐病、产量稳定以及果实品质好等优点,所以尽管其对速衰型 衰退病敏感,但目前仍是美国、中美洲等地区重要的砧木品种(Hifny et al.,2012;Lee & Keremane, 2013)。为保护酸橙砧木免受速衰型衰退病的为害,延长其使用寿命,研究人员一直在开展交叉保 护防治速衰型衰退病的研究。 在早期研究中,Wallace 和 Drake(1976)和 van Vuuren 等(1991)从感染苗黄型衰退病后又症 状消失的植株中获得了数十个 CTV 弱毒株,并将其用于防治速衰
22、型衰退病,但未能成功。随后,在 美国(佛罗里达)、巴西、委内瑞拉等也开展了类似研究,但绝大多数 CTV 弱毒株仅能在接种后 1 3 年内延缓速衰症状的发生(Ochoa et al.,1993;Roistacher & Dodds,1993;Lee & Keremane, 2013)。虽然 Powell 等(1999)筛选出的 CTV 弱毒株 DD 102bb,Guettler HS 和 DPI 1-12-5-X-E 能 分别保护以酸橙作砧木的甜橙和红宝石葡萄柚长达 8 年和 16 年以上,但由于 20 世纪 90 年代后 期褐色橘蚜侵入美国佛罗里达,同时引入了新的速衰型强毒株,从而导致原有弱毒
23、株的保护效果迅 速丧失。在褐色橘蚜侵入佛罗里达 5 年后,仅有不到 1/3 的预免疫酸橙砧红宝石葡萄柚未感染 速衰型衰退病(Powell et al.,2003)。截止目前虽然已有数百个 CTV 弱毒株被用于了田间试验,但 均不能对速衰型衰退病产生持久的防治效果(Roistacher & Dodds,1993;Albiach-Mart et al.,2010; Lee & Keremane,2013)。 5 交叉保护机理研究 在早期研究中发现,交叉保护对柑橘衰退病的防治效果主要依赖于强弱毒株间基因序列同源性 程度, 由此推测转录后基因沉默 (PTGS) 与交叉保护防治柑橘衰退病的机理有关 (Z
24、hou et al., 2002) 。 随后,Fagoaga 等(2006)和 Ruiz-Ruiz 等(2011)观察到墨西哥莱檬在感染 CTV 后会产生大 量来源于 CTV 的特异性小 RNA,以及转录区甲基化等现象。此外,在预免疫植株中虽然 CTV 弱毒 株仅分布于不足 1/3 的寄主细胞, 但所有的寄主细胞都会对随后拮抗接种的基因型相同的 CTV 强毒 株具有免疫能力,由此推测在交叉保护防治柑橘衰退病的过程中存在类似 PTGS 中的信号传递 (Folimonova et al.,2008,2010) 。上述研究结果都进一步表明,PTGS 是交叉保护防治柑橘衰退病 9 期 周 彦:交叉保护
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