大白菜、青花菜和叶用芥菜体细胞杂交种形态学与细胞学特性鉴定.pdf
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1、园艺学报,() : 2011381120992110 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: 收稿日期:收稿日期:20110831;修回日期:修回日期:20111012 基金项目:基金项目:山东省自然科学基金项目(Y2008D17) 大白菜、 青花菜和叶用芥菜体细胞杂交种形态学 与细胞学特性鉴定 廉玉姬*,林光哲,赵小梅 (临沂大学生命科学学院,山东临沂 276005) 摘 要:摘 要:为拓宽十字花科蔬菜育种种质资源,以大白菜(Brassica campestris L. ssp. pekinensis)、青 花菜
2、(B. oleracea L. var. varitalica)和叶用芥菜(B. juncea L. Czern)的子叶、下胚轴为材料,分离、纯 化原生质体,采用 40% 聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)融合法进行原生质体融合。融合细胞在附 加 0.2 mg L-1 2,4-D + 0.5 mg L-1 6-BA + 0.1 mg L-1 NAA + 0.1 mg L-1 激动素(kinetin)的改良K8p培 养基中液体培养,当细胞分裂至 8 10 细胞期时,将分裂的细胞包埋于 0.15%琼脂糖,然后在添加 0.3 mol L-1蔗糖和 2 mg L-1 6-BA
3、+ 2 mg L-1 玉米素 (zeatin) + 1 mg L-1 NAA + 0.5 mg L-1 kinetin的Kao培养基中诱 导愈伤组织。将培养获得的 936 个愈伤组织转到 3 种不定芽诱导培养基MS + 5 mg L-1 zeatin + 2 mg L-1 IAA;MS + 2 mg L-1 zeatin + 2 mg L-1 IAA;MS + 0.5 mg L-1 6-BA + 0.5 mg L-1 NAA上诱导芽分化,当 芽长 3 cm左右时,转到 1/2 MS + 0.2 mg L-1 NAA的生根培养基上诱导生根,共获得了 96 株再生植株, 对其进行形态学、细胞学和分
4、子生物学鉴定。形态学观察显示再生植株表型变化大,包括 3 个亲本的中 间型或两个亲本的中间型; PCR技术鉴定结果显示 96 株杂种植株中 93 株为细胞质雄性不育特性; 染色体 计数显示,再生的植株染色体数变化范围广(2n = 38 64),但未发现染色体数总和与 3 种融合亲本染 色体数总数(2n = 74)相一致的个体。基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization,GISH)和扩增片 段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)分析结果表明,再生植株基因组中分别 检测出大白菜、青花菜、叶用芥菜的DNA
5、片段,证实了大白菜、青花菜、叶用芥菜种间体细胞杂交种的 真实性。 关键词:关键词:芸薹属;体细胞杂交;原生质体;植株再生;形态学;基因组原位杂交(GISH) 中图分类号:中图分类号:S 634.3;S 635;S 637.2 文献标识码:文献标识码:A 文章编号:文章编号:0513-353X(2011)11-2099-12 Morphological and Cytological Characterization of Somatic Hybrids Obtained by Tri-parental Protoplast Fusion in Brassica Species LIAN Yu-
6、ji*,LIN Guang-zhe,and ZHAO Xiao-mei (College of Life Science,Linyi University,Linyi,Shandong 276005,China) Abstract: To obtain various genetic resources, interspecific tri-parental somatic hybridization among Brassica campestris L. ssp. pekinensis (2n = 20, AA) , B. oleracea L. var. varitalica (2n =
7、 18,CC) ,and B. juncea L. Czern(2n = 36,AABB)was performed. Protoplasts were isolated from hypocotyls and * E-mail: 2100 园 艺 学 报 38 卷 cotyledons,and fused using the 40% polyethylene glycol(PEG). Fused protoplast were cultured in modified K8p medium supplemented with 0.2 mg L-1 2,4-D,0.5 mg L-1 6-BA,
8、0.1 mg L-1 NAA,and 0.1 mg L-1 kinetin,and 0.4 mol L-1 mannitol as osmoticum. At the 810-cell stage,divided cells were transferred to Kaos basal medium supplemented with 0.3 mol L-1 sucrose as carbon source,and 0.15% agarose,2 mg L-1 6-BA,2 mg L-1 zeatin,1 mg L-1 NAA,0.5 mg L-1 kinetin for callus pro
9、liferation. After 35 days,when small calli reached 23 mm in diameter,calli were transferred to regeneration medium(MS + 5 mg L-1 zeatin + 2 mg L-1 IAA; MS + 2 mg L-1 zeatin + 2 mg L-1 IAA; MS + 0.5 mg L-1 6-BA + 0.5 mg L-1 NAA) . A total 96 regenerated plants were obtained from 932 calli. Several ph
10、enotypes were obtained in the somatic hybrids,showing differences in leaf morphology,flower size and color. Most of the plants showed intermediate characteristics between two or more of the parental species. Cytoplasmic male sterility(CMS) identified by polymerase chain reaction(PCR)amplification us
11、ing Ogura CMS specific primers. Putative somatic hybrids were identified by cytological and morphological analyses. The chromosome numbers of the somatic hybrids varied from 38 to 64,which was less than the sum of the parental lines. The somatic hybiridity was confirmed by Genomic in situ hybridizat
12、ion (GISH) and amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis. Key words: Brassica; interspecific; tri-parental somatic hybridization; protoplast; plant regeneration; morphology;genomic in situ hybridization 由于人类长期定向选择,导致主要农作物的遗传多样性已经远远小于其原始物种,日益变窄的 遗传基础已成为限制育种发展的主要因素(Tanksley EG: Leaves of
13、three fusion parents of B. oleracea, B. juncea, B. campestris (from left to right) ; HK: Leaves of somatic hybrids with intermediate leaves;L:Broccoli like leaves;M:Curly leaves;N:A young plant of B. juncea(Leaf mustard) ;O:B. oleracea(Broccoli); P:B. campestris (Chinese cabbage);QV:Putative somatic
14、 hybrids with various morphologies produced among three parents of B. oleracea,B. campestris and B. juncea;WY:Bolting behaviors of putative somatic hybrids. 2104 园 艺 学 报 38 卷 表表 1 不同种类和浓度植物生长调节剂对不定芽诱导的影响不同种类和浓度植物生长调节剂对不定芽诱导的影响 Table 1 Effects of plant growth regulators on plant regeneration from pro
15、toplast fusion derived calli 芽诱导培养基 Shoot induction medium(SIM) 愈伤数 Number of callus 植株再生率/% Plant regeneration frequency SIM1(5 mg L-1 zeatin + 2 mg L-1 IAA) SIM2(2 mg L-1 zeatin + 2 mg L-1 IAA) SIM3(0.5 mg L-1 6-BA + 0.5 mg L-1 NAA) 311 310 311 24.12 5.14 1.61 大白菜、青花菜、叶用芥菜的原生质体单独培养时发现,培养 2 7 d,大白菜
16、原生质体没有发 生分裂,青花菜和叶用芥菜的原生质体个别发生第 1 次分裂;培养 10 d 后观察,3 种亲本细胞单独 培养没有发生进一步的分裂,最终未能获得再生植株。 2.2 形态学观察 在温室培养条件下,再生植株长势旺盛。亲本植株与再生植株叶形的比较见图 1。 青花菜的叶片呈椭圆形,蓝绿色,叶缘锯齿状,有叶耳,叶面光滑无毛,叶柄窄(图 1,E); 叶用芥菜和大白菜叶片卵圆形,绿色,叶缘波纹型,无叶耳,叶面有被毛,叶柄宽(图 1,F、G)。 再生植株叶片基本分为 4 种类型: 第 1 种,叶片呈绿色,叶缘圆齿状波纹,有叶耳,叶片皱褶,叶柄宽,叶脉与大白菜相似,叶 面有被毛(图 1,H J)。
17、第 2 种,叶片呈绿色,叶缘钝齿状波纹,有叶耳,叶片皱褶,叶柄窄,叶脉中间型,叶表面无 被毛,但有蜡层(图 1,K)。 第 3 种,叶片类似青花菜(图 1,L)。 第 4 种,叶片蓝绿色,叶缘圆齿状波纹,无叶耳,叶片严重皱褶,叶脉类似青花菜,叶表面无 被毛,但有蜡层(图 1,M)。 总之,再生植株的叶片形态、颜色、叶毛的有无等呈现多样性分布。除此之外,再生植株的叶 片厚度、叶表面覆盖的蜡粉或蜡层、绒毛特征有很大的差异。 亲本植株和再生植株的株型差异较大(图 1,N V)。再生植株分为 4 种基本株型: 第 1 种,植株的表型介于青花菜与叶用芥菜之间(图 1,Q、R)。 第 2 种,植株的表型介
18、于青花菜和大白菜之间(图 1,S、T)。 第 3 种,植株表型独特、典型的 3 种融合杂交后代的表型(图 1,U)没有 1 株具有大白菜或叶 用芥菜的表型。 第 4 种,植株的表型类似青花菜(图 1,V)。 经过 2 个多月的生长,多数的再生植株未经春化处理就开始抽薹,类似青花菜,但是其亲本芥 菜、大白菜并不抽薹。大白菜和叶用芥菜经过春化处理之后开始抽薹,其形态类似青花菜(图 1, W);分支、松散的总状花序;抽薹开花时期也不同。再生植株的抽薹、分支与花序比较多样(图 1,X、Y)。 花的形状、大小和颜色也呈现多样性(表 2) ,花色有亮黄、黄色、淡黄色、黄花带白色条纹。 雌蕊和雄蕊的比例也呈
19、现多样性,雄蕊/雌蕊 1,雄蕊/雌蕊 1,或雄蕊/雌蕊 1 1 1 1 1 1 无雄蕊 No stamens 无雄蕊 No stamens 1 1 1 1 1 圆形 Round 圆形 Round 圆形 Round 圆形,卷曲 Round,curly 圆形 Round 圆形 Round 椭圆形 Oval 长椭圆形 Narrow oval 长椭圆形 Narrow oval 圆形 Round 椭圆形 Oval 椭圆形 Oval 椭圆形,有斑点花瓣 Spotted petal 椭圆形,有斑点花瓣 Spotted petal 圆形 Round 圆形 Round 无 Empty 无 Empty 无 Emp
20、ty 无 Empty 无 Empty 无 Empty 有 Full 无 Empty 无 Empty 无 Empty 无 Empty 无 Empty 无 Empty 无 Empty 有 Full 有 Full 2.3 再生植株CMS特性鉴定 用 PCR 方法扩增线粒体 DNA 的 Ogura CMS 特异性区域, 结果显示 96 株再生植株中 93 株显示 了 0.5 kb 特异性条带,3 株未显示特异性条带。这表明 CMS 特性成功地转入到再生植株中。图 2 为 12 株杂种细胞及亲本植株的 PCR 分析结果,除 8 号外均有 0.5 kb 特异性条带。 图图 2 杂种细胞及其双亲植物的杂种细
21、胞及其双亲植物的 PCR 分析分析 M:Marker;P1:叶用芥菜;P2:青花菜;P3:大白菜;1 12:体细胞杂交种。 Fig. 2 PCR analysis with mitochondria CMSspecific primers M:Marker;P1:B. juncea(Leaf mustard);P2:B. oleracea(Broccoli);P3:B. campestris(Chinese cabbage); 112:Somatic hybrids with CMS specific band. 2.4 染色体计数与基因组原位杂交 2.4.1 染色体计数 选取 96 株再生植
22、株的根尖,进行染色体数的测定。显微观察发现,再生植株的染色体数为 2n = 38 64(图 3,A F)。根据染色体数可将再生植株分成 5 种类型。第 1 种,包括 5 株,染色体数 为 2n = 38(图 3,A),与大白菜和青花菜的染色体数总和相一致。第 2 种,包括 5 株,染色体数 为 2n = 54(图 3,B),与叶用芥菜和青花菜的染色体数总和相一致,其中包括 3 株没有显示 CMS 特异性条带的植株。第 3 种,包括 30 株,染色体数表现出多态性,变化范围为 2n = 46 48(图 3, C)。第 4 种,包括 44 株,染色体数为 2n = 50 58(不包括 54 条,图
23、 3,D、E)。第 5 种,包括 12 株,染色体数为 2n = 64,大于任何两个亲本的染色体数的总和,但是小于 3 个亲本的染色体数 的总和(图 3,F)。 2106 园 艺 学 报 38 卷 图图 3 体细胞染色体数与基因组原位杂交分析体细胞染色体数与基因组原位杂交分析 A:再生植株染色体 2n = 38;B:再生植株染色体 2n = 54;C:再生植株染色体 2n = 48;D:再生植株染色体 2n = 56; E:再生植株染色体 2n = 52;F:用碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色的再生植株染色体 2n = 64; G:以叶用芥菜基因组 DNA 为探针的再生植
24、株染色体;H:以大白菜基因组 DNA 为探针的再生植株染色体;I:以青花菜基因组 DNA 为探针的再生 植株染色体(箭头表示探针信号)。 Fig. 3 Chromosomes of cells of a root tip in somatic hybrids and genomic in situ hybridization A:2n = 38;B;2n = 54;C:2n = 48;D:2n = 56;E:2n = 52;F:Mitotic cells of somatic hybrids,counterstained by propidium iodide(PI)2n = 64;G:GIS
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