松花粉对慢性应激大鼠肠道微生态的影响.pdf
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1、松花粉对慢性应激大鼠肠道微生态的影响 白树民1 高爱新2 雷浪伟1 李培荣1 李红毅1 郑珍2 杨小明2 ( 1 中国航天员科研训练中心,北京,1 0 0 0 9 4 2 中国林科院松花粉研究开发中心,浙江,杭州,3 1 1 4 0 0 ) 摘要目的观察慢性应激对大鼠肠道微生态的影响及松花粉的保健作用。方法采用大鼠慢 性应激动物模型,3 种刺激因素嗓声、强迫游泳和头低位束缚随机作用于大鼠,实验期7 周 左右。用选择性培养基平皿计数法检测大鼠粪便菌群中几种代表性菌种的数量;用酶联免疫 法测定大鼠血清中应激激素的含量。结果慢性应激实验对照组大鼠,粪便中以益生菌双歧 杆菌为主的原籍菌数量减少,而过路
2、菌肠杆菌和肠球菌相应增多,即发生了肠道微生态紊乱 的现象;进食含5 松花粉饲料的实验组大鼠双歧杆菌数量减少不明显。结论在慢性应激条 件下,大鼠发生了以原籍菌双歧杆菌减少为特征的肠道微生态紊乱的现象,食用松花粉能够 有效减轻慢性应激因素导致的大鼠肠道微生态紊乱。 关键词慢性应激;噪声;强迫游泳;头低位束缚;微生态;肠道菌群;双歧杆菌;松花粉 中图分类号:文献标识码:A 文章编号: 本实验室曾对模拟失重条件下大鼠肠道菌群方面的变化进行过观察研究,发现在模拟 失重条件下大鼠肠道菌群失调,表现为原籍菌中对机体有益的厌氧茵双歧杆菌数量下降, 过路菌中需氧的条件致病菌大肠杆菌和肠球菌数量增加;在大鼠饲料中
3、添加功能性低聚糖 水苏糖可以改善模拟失重大鼠肠道菌群失调【l 】。然而,失重只是航天环境因素中的一个方 面,噪声、狭小空间( 束缚) 、恐惧( 束缚) 和疲劳( 体力上和心理上的) 等因素也不可 避免地会作用于航天员的身体,使航天员处于一种应激状态,导致神经内分泌的变化,从 而造成全身各器官和系统的改变。这种变化应该也会对航天员肠道微生态平衡产生负面影 响。俄罗斯( 前苏联) 研究人员发现,航天期间所有航天员都发生程度不同的肠道菌群失 调,这种失调的特点为以厌氧菌为代表的“屏障“ 微生物种群数量降低,直至完全消失, 在原籍菌的生境中出现过路菌及条件致病菌,这种变化即所谓的肠道微生态紊乱,能够对
4、 航天员的健康构成潜在威胁。研究表明,机体胃肠道微生态的平衡与稳定受多种体内外因 素的影响。航天特殊环境因素以及神经和情绪紧张,在航天员自身微菌群生态紊乱的形成 与发展中具有重要作用。理论和实践都证实,保持机体肠道微生态平衡对维护航天员的健 康和佳态是十分必要的1 2 。 目前尚未见国内有关于在慢性应激条件下机体肠道微生态变化方面的报道。本研究拟 利用复合因素大鼠慢性应激模型,观察大鼠以肠道微菌群改变为主的生理生化变化情况, 探讨慢性应激条件对机体肠道微生态的影响及可能的机理。通过给大鼠饲料中添加松花粉 类保健食品材料,观察其对慢性应激条件下机体的保健作用。为从膳食营养途径防护和改 善慢性应激
5、因素所致航天员的亚健康状态提供实验依据,开拓松花粉保健应用的新领域。 方法 实验材料 基础饲料:S P F 级大、小鼠生长维持粉末饲料,北京科澳协力饲料有限公司生产。 松花粉:中国林业科学院松花粉研究开发中心当年产破壁松花粉。 水苏糖:西安德施普生物制品有限责任公司生产。 大鼠:S P F 级清洁S D 雄性大鼠,体重1 2 0 1 0 克,由北京动物实验中心提供。 大鼠实验分组及应激动物模型的建立 1 0 8 动物购回后适应性喂养3 天后进行分组。根据动物体重将动物随机平均分为4 组, 每组1 0 只:正常对照组( N o r m a lC o n t r o l ,N C ) ,饲喂大鼠基
6、础饲料;慢性应激对照组( C h r o n i c S t r e s sC o n t r o l ,s c ) ,饲喂大鼠基础饲料;慢性应激松花粉组( C h r o n i cS t r e s sP i n eP o l l e n ,P P ) , 饲喂在大鼠基础饲料中添加了5 亚林松花粉的饲料;慢性应激水苏糖组( S t a c h y o s e ,S T ) , 饲喂在大鼠基础饲料中添加了1 水苏糖的饲料。所有大鼠均饮用纯净水,实验期间大鼠 自由进食和饮水。 慢性应激动物模型采用三种刺激因素建立慢性应激动物模型: 头低位束缚束缚造模用采用自己研制的束缚筒。该筒由两部分组成,前
7、部为铁皮制 作的圆椎管形铁筒,长5 c m ,大口内径6 c m ,小口内径2 c m ,大口与一长2 5 c m 的布质袖 套连接,袖套开口直径8 1 0 c m ,为大鼠的进入口,实物见图l 。大鼠置入后,驱使其头 部进入铁皮椎管内,然后紧贴鼠身体束紧布套,在尾部用别针别住,使其无活动空间。大 鼠固定后,将其头低位放置在坡度为1 5 2 0 。的斜面上,时间为6 h 。 强迫游泳大鼠在水深5 0 c m ,直径为8 0 c m 的水箱中游泳,水温控制在2 5 士2 左右, 将大鼠尾部系1 5 体重的负荷,记录游泳开始到衰竭( 鼻子没入水中8 秒钟为止) 的时间。 另外,大鼠进食量的多少会影
8、响称重和游泳时间,在试验前禁食1 2 h 。 噪声刺激噪声条件为15 0 0H z ,9 2d B ,每次1h ,在本所噪声实验室中进行。 动物分组后进食相应的饲料,一周后开始正式实验( 目的是观察各组大鼠的初始状态 是否有所不同) 。每天随机选一种应激方式作用于应激组的动物,实验期4 6 天。具体过 程为:第l 、6 、9 、1 0 、1 3 、1 8 、2 0 、2 1 、2 2 、2 4 、2 7 、3 1 、3 2 、3 5 、3 8 、4 0 、4 3 、4 5 天噪声应激:第2 、5 、8 、1 2 、1 5 、1 7 、2 3 、2 6 、3 0 、3 3 、3 6 、3 9 、
9、4 1 、4 4 天强迫游泳; 第3 、4 、7 、1 1 、1 4 、1 6 、1 9 、2 5 、2 8 、2 9 、3 4 、3 7 、4 2 、4 6 天束缚应激。对照组在不受 实验应激原的影响下,同期饲养4 6 天。大鼠每次进行游泳实验时称一次体重,观察其一 般生长情况。 大鼠肠道菌群分析 粪便标本采集分别在正式实验开始前1 d ( 第O d ) ,实验开始后第7 d 、2 1 d 、2 8 d 、3 2 d 、 3 5 d 和4 2 d ,采取逼迫法取大鼠新鲜粪便,第4 7 d 处死大鼠后采取盲肠内容物,进行粪便 菌群分析。 粪便细菌培养按照熊德鑫1 厌氧菌分离鉴定方法制备选择性需
10、氧培养基( E M B 、E C ) 以及厌氧培养基( K V 、T P Y 、M R S ) 。采样取大鼠新鲜粪便O 1 9 左右,立即装入已称重并装 有4 m l 生理盐水和2 - 3 粒玻璃珠的无菌试管中,装样后的试管再次称重,求得样本重量, 盖好管塞后放在液体快速振荡器上混合,制成均匀悬液,然后用生理盐水以1 0 倍的比例 倍比稀释成系列。取上述处理的样本系列稀释液0 O l m l 接种到五种选择性培养基上,分 别置于厌氧和需氧环境中培养。需氧培养3 7 2 4 h 观察结果,厌氧培养4 8 h 后观察结果, 记录菌落数。 计算公式:每克粪便中的活菌集落数对数值C F U g = l
11、 o g 标本重量( g ) + 稀释液量( m 1 ) 标本重量稀释度菌落个数x1 0 0 ) 生化指标的测定实验结束日采用断头法处死大鼠,收集血液,室温下凝固2 0 m i n , 低温离心分离血清( 4 、4 0 0 0 r p m ) ,进行血生化指标和免疫指标的测定。采用双抗体夹 心A B C - E L I S A 法测定大鼠血清中的促肾上腺皮质激素释放激素( C R H ) 和促肾上腺皮质 激素( A C T H ) 。 统计分析所有实验数据均用S P S S11 0 统计软件进行方差分析并作t 一检验。 结果,H , 慢性应激对大鼠体重增长的影响在实验期间,对大鼠体重增长情况进
12、行了观察,观 察结果见表l 。 1 0 9 表1 实验期大鼠体重增长情况( g ,X 4 - S D ,n = 8 ) T a b 1T h er e s u l t so ft h er a t s b o d yw e i g h td u r i n ge x p e r i m e n t G r o u p d 7 d 1 4d 2 2d 2 8 d 3 5 d 4 1d 4 7 N O2 4 4 4 - 1 32 9 3 士2 23 3 8 士3 l3 6 5 4 - 3 33 8 6 士3 2 4 1 6 4 - 3 0 4 1 9 士2 6 S T2 2 8 士9 牛2 6 9
13、 士1 3 +2 9 7 士1 6 $ +2 9 7 4 - 1 6 +3 2 1 士1 5 3 4 8 士1 4 幸+3 5 7 士1 3 母 P P2 2 2 圭9 牛卑 2 6 5 士1 3 卑宰 2 9 4 士2 1 唯章 3 1 6 土2 5 奉+3 3 6 4 - 3 0 * *3 4 9 士3 2 木阜3 6 2 3 5 奉+ S C2 3 4 4 - 1 42 7 2 士2 33 0 2 士2 9 3 2 6 士3 l 奉3 4 8 士3 5 牛3 5 2 士3 1 拳事3 6 2 士2 9 奉奉 注:牛表示组问比较差异有显著性,p 0 。0 5 ;宰宰表示组间比较差异有极显著
14、性,p 0 0 1 。 均为与N C 组相比,下同。 从表l 可以看出,在慢性应激实验期间,从第1 周起,S T 和P P 组大鼠的体重增长 速度明显减慢,从第3 周起,S C 组大鼠的体重增长速度也开始明显减慢。 慢。 生应激对大鼠肠道菌群的影响在实验期间,每隔5 - 7 天进行一次大鼠粪便菌群分 析,检测结果见表1 - 5 。实验初始检测结果各组无差别,资料未给出。 表2 大鼠粪便双歧杆菌检测结果 x S ,x = L o g ( C F U g ) ,n = 8 T a b 2T h ea m o u n t so fb i n d o b a c t e r i ai nr a t S
15、f e c e s g r o u p d 7d 2 l d 2 8d 3 2 d 3 5 d 4 2d 4 7 N C8 7 0 士O 4 58 1 9 4 - 0 1 88 5 4 士0 6 4 8 1 9 4 - 0 6 88 4 8 士0 2 78 6 5 士0 4 0 8 18 士0 5 4 P P8 5 8 士0 2 l8 0 8 士0 3 98 8 8 士0 8 58 4 5 士0 6 98 。2 6 士O 4 38 4 2 4 - 0 ,4 48 1 38 士0 4 6 S T8 3 5 0 2 28 6 3 4 - 0 8 2 *8 2 7 士0 6 2 8 1 5 + 0
16、4 58 4 2 士0 5 87 8 8 士0 6 l 8 1 4 士O 4 2 S C8 1 8 士O 4 l 幸木8 1 9 士O 2 58 3 0 士O 6 7 *8 3 0 4 - 0 6 08 1 4 1 - 0 4 2 *8 11 4 - 0 5 5 *8 0 8 士O 5 7 * 从表2 可以看出,在慢性应激实验期间,S C 组大鼠与其他各组大鼠相比,粪便双歧 杆菌的数量总体呈下降趋势。而P P 组大鼠则不明显。 表3 大鼠粪便乳杆菌检测结果 z s ,X = L o g ( C F U g ) ,n = 8 T a b 3T h ea m o u n t so fl a c t
17、 o b a c i l l ii nr a t Sf e c e s g r o u p d 7d 2 ld 2 8d 3 2d 3 5d 4 2d 4 7 N C8 5 8 士0 4 58 2 3 士O 6 2 9 0 2 士0 4 2 8 8 8 士O 2 78 8 3 士0 2 3 8 8 9 4 - 0 3 58 4 8 士O 8 0 P P 8 7 8 士O 2 58 5 4 4 - 0 3 59 1 7 4 - 0 :7 08 6 3 4 - 0 5 38 4 9 士0 3 28 5 1 4 - 0 3 68 5 4 士O 2 2 S T8 4 3 :t :0 2 48 7 7
18、士O 7 88 5 5 4 - 0 5 38 5 3 士0 4 88 3 9 士0 3 08 6 2 4 - 0 2 48 3 9 士O 2 3 S C8 0 8 士O 2 4 *8 6 2 0 3 68 9 7 4 - 0 1 98 8 1 士O 2 28 6 6 士0 2 4 8 6 8 士0 3 3 8 2 4 士O 3 3 从表3 可以看出,在慢性应激实验期间,S C 组大鼠与其他各组大鼠相比,粪便乳杆 菌的数量除在第l 周降低外,其他时间各组大鼠均无明显差异。 表4 犬鼠粪便类杆菌检测结果 x S ,x = L o g ( C F U g ) ,n = 8 T a b 4T h ea
19、 m o u n t so f b a c t e r o i d si nr a t sf e c e s g r o u p d 7 d 2 1d 2 8d 3 2d 3 5d 4 2d 4 7 N C 9 4 8 4 0 4 78 9 5 4 0 3 9 8 9 3 + 0 1l8 8 3 4 - 0 21 8 6 0 + 0 3 5 8 8 5 士O 2 79 1 4 4 - 0 3 9 P P 9 1 0 + 0 2 8 8 9 3 土0 2 49 2 7 士0 6 89 0 8 士O 4 58 8 2 士0 2 49 1 8 士O 4 39 1 0 + 0 3 7 S T9 3 6
20、 - 4 - 0 519 1 1 + 0 9 58 4 5 4 0 4 78 8 5 士O 2 89 0 4 士0 3 88 8 1 4 - 0 3 0 8 6 8 士0 1 2 S C8 7 9 0 2 8 *9 1 4 + 0 4 38 9 6 4 0 2 79 1 0 + 0 2 69 11 士0 4 1 9 2 9 4 - 0 2 88 5 8 4 0 14 奉 l I O 从表4 可以看出,在慢性应激实验期间,S C 组大鼠与N C 组和P P 组大鼠相比,除第 ? 1 周和第7 周两次检测结果粪便类杆菌的数量明显下降。其他时间各组大鼠间的差异均不 明显。 表5 大鼠粪便肠球菌检测结
21、果 x S ,X = L o g ( C F U g ) ,n = 8 T a b 5T h ea m o u n t so fe n t e r o c o c c ii nr a t sf e c e s g r o u p d 7d 2 ld 2 8d 3 2d 3 5d 4 2d 4 7 N C6 4 7 士0 9 47 38 士0 6 37 3 7 0 3 96 8 8 士O 6 77 0 1 士0 5 46 5 4 士0 3 36 4 6 士0 3 9 P P 6 7 6 士0 2 67 51 士0 2 8 7 2 0 士0 6 96 7 9 + 0 2 66 7 3 士O 4 0
22、7 3 0 士0 4 9 *6 0 5 士0 5 3 S T7 2 2 士0 5 56 8 8 士O 1 76 9 8 + 0 4 0 *6 6 9 :1 :0 4 2 6 6 3 士O 2 4 6 3 8 士O 2 9 5 。7 5 士0 。4 8 S C8 1 8 士O 4 1 幸6 7l 士O 5 07 8 3 士O 5 77 2 9 + 0 4 6 *7 。1 6 士0 1 8 卑7 。3 6 + 0 4 4 * 6 2 6 士1 0 2 从表5 可以看出,在慢性应激实验期间的大多数时间,S C 组大鼠与其他各组大鼠相 比,粪便肠球菌的数量明显升高。 表6 大鼠粪便肠杆菌检测结果 x
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