《水稻淡绿叶突变体HM14的遗传分析与基因定位.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《水稻淡绿叶突变体HM14的遗传分析与基因定位.pdf(6页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、水稻淡绿叶突变体HM 的遗传分析与基因定位 施勇烽 魏彦林 奉保华 王惠梅 徐霞 黄奇娜 吕向光 张晓波 吴建利 ( 中国水稻研究所 水稻生物学国家重点实验室/国家水稻改良中心,杭州 ;共同第一作者;通讯联系人,E m a i l:b e i s h a n g d c o m) G e n e t i cA n a l y s i sa n dG e n eM a p p i n go fP a l eG r e e nL e a fM u t a n tHM i nR i c e SH IY o n g f e n g ,WE IY a n l i n,F E NGB a o h u a,
2、WANGH u i m e i,XUX i a,HUANGQ i n a,LVX i a n g g u a n g, ZHANGX i a o b o,WUJ i a n l i (S t a t e K e y L a b o r a t o r yo f R i c eB i o l o g y,C h i n a N a t i o n a lR i c eR e s e a r c hI n s t i t u t e,H a n g z h o u ,C h i n a;T h e s ea u t h o r s c o n t r i b u t e de q u a l l
3、yt o t h i sp a p e r; C o r r e s p o n d i n ga u t h o r, E m a i l:b e i s h a n g d c o m) S H IY o n g f e n g,WE IY a n l i n,F E N GB a o h u a,e t a l G e n e t i c a n a l y s i s a n dg e n em a p p i n go f p a l eg r e e n l e a fm u t a n tHM i nr i c e C h i nJR i c eS c i, , () : A b
4、 s t r a c t:T h ep a l e g r e e n l e a fm u t a n tHM w a s i s o l a t e d f r o ma nEM S i n d u c e d I R m u t a n t b a n k T h em u t a n t s h o w e d as t a b l ep a l e g r e e nl e a fp h e n o t y p et h r o u g h o u t t h ew h o l el i f ec y c l e T h ep l a n th e i g h to fHM d e
5、c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y w h i l eo t h e ra g r o n o m i ct r a i t sw e r el a r g e l ys i m i l a rt ot h ew i l d t y p eI R T h ec h l o r o p h y l lc o n t e n to fHM r e d u c e d n o t a b l ya t t i l l e r i n gs t a g ew h e nc o m p a r e dw i t hI R T h en e tp h o t o
6、s y n t h e t i c r a t eo fHM w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h ew i l d t y p e I R a t f i l l i n gs t a g ew h i l e t h e t r a n s p i r a t i o nr a t ew a s r a i s e ds i g n i f i c a n t l y G e n e t i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e p a l eg r e e nl e a
7、 fp h e n o t y p ew a sc o n t r o l l e db yas i n g l er e c e s s i v eg e n e T od e t e r m i n et h el o c a t i o no ft h eg e n e,b u l k e d s e g r e g a n t a n a l y s i sw a sc a r r i e do u tu s i n gb o t ht h em u t a n ta n dw i l d t y p eD NA p o o l s T h eg e n e p g l HM w a
8、sf i n a l l y d e l i m i t e dt oar e g i o no f k bb e t w e e nS S Rm a r k e r sRM a n dRM o nt h es h o r t a r mo f c h r o m o s o m e K e yw o r d s:r i c e;p a l eg r e e n l e a fm u t a n t;c h l o r o p h y l l c o n t e n t;g e n em a p p i n g 施勇烽,魏彦林,奉保华,等水稻淡绿叶突变体HM 的遗传分析与基因定位中国水稻科学,
9、 , () : 摘 要:淡绿叶突变体HM 是通过EM S诱变籼稻I R 获得的, 整个生育期叶色均保持淡绿.与野生型相比, 突变体除了 株高显著降低外, 其他农艺性状未发生显著改变.光合色素含量和光合指数测定结果表明, 突变体的叶绿素a、b含量较野 生型I R 明显下降, 突变体的净光合速率显著降低, 但蒸腾速率明显上升, 光合作用受到显著影响.遗传分析结果表明, 突 变体淡绿叶性状受一对隐性核基因控制.构建突变体HM 与M o r o b e r e k a n的F分离群体作为基因定位群体, 将该淡绿叶 基因p g l HM 定位在第 染色体短臂 RM 和RM 两个标记之间大约 k b区间内
10、. 关键词:水稻;淡绿叶突变体;叶绿素含量;基因定位 中图分类号:Q ;Q ;S 文献标识码:A 文章编号: ( ) 叶绿素是一类极其重要的生物分子, 在每一种 植物中有稳定的含量, 自然变异或人工诱变可导致 某些基因的突变并影响叶绿素含量, 产生各种类型 的叶色突变体.迄今已在水稻 、 拟南芥 、 玉 米 、 大麦、 小麦等多种植物中发现了叶色突变 体. 水稻作为重要的粮食作物和单子叶模式植物, 其叶色突变体的研究尤其受到重视.目前已鉴定的 水稻叶色突变体约 个 , 包括白化、 黄化、 淡绿、 条斑、 斑马叶等多种表型.绝大多数水稻叶色突变 体受核基因控制, 仅有极少数受细胞质基因控制 .
11、在核基因控制的叶色突变体中, 受一对隐性基因控 制的情况最多, 由显性基因 和多基因控制的情况 较少 . 随着功能基因组学的发展, 克隆鉴定的基因越 来越多, 目前已克隆的水稻叶色基因近 个.这些 基因包括叶绿素合成与降解途径相关基因 , 以 及其他编码叶绿体蛋白相关的基因 , 但尚未克 隆到与血红素途径相关的基因.这些基因的变异均 对 叶色的变化产生重要的影响. 例如,O s CHLH 收稿日期: ;修改稿收到日期: . 基金项目:国家 计划资助项目( AA , AA A ) ; 水稻生物学国家重点实验室自主课题资助项目(Z Z K T ) . 中国水稻科学(C h i nJR i c eS
12、 c i) , , ( ) : h t t p: / /w w w r i c e s c i c n D O I: /j i s s n 基因是最早克隆的水稻叶色基因, 是叶绿素合成途 径中的一个重要基因, 该基因编码镁螯合酶H亚 基, 由于T D NA插入到O s CHLH第内含子中, 导致镁螯合酶失活, 纯合型突变体苗期致死, 叶绿素 含量仅为野生型的左右 .再如, 鸟苷酸激酶 可能参与叶绿体蛋白的合成或装配, 水稻中该基因 的突变可造成叶绿体分化受阻, 在特定温度下突变 体叶片因不含绿色素而呈白色 . 本研究在籼稻I R 的EM S突变体库中发现 了一份淡绿叶突变体HM , 对突变体的
13、表型和生 理特征以及主要农艺性状进行了观察, 并对淡绿叶 基因 p g l HM 进行遗传分析和基因定位, 以期为该 基因的克隆、 功能分析及其育种应用奠定基础. 材料与方法 供试材料和主要农艺性状调查 HM 是由化学诱变剂EM S处理籼稻I R 获得的一份淡绿叶突变体, 经多代自交, 其淡绿叶性 状已稳定遗传.于 年将该突变体HM 与野 生型I R 种植于中国水稻研究所实验基地, 每个 材料各行 株, 株行距 c m c m, 成熟期 分别调查中间行中间株的株高、 穗长、 单株有效分 蘖数、 结实率、 千粒重等农艺性状, 取其平均值. 光合色素含量测定 光合色素含量测定参照A r n o n
14、和W e l l b u r n等 的方法 .分 蘖 期 取 突 变 体 HM 及 野 生 型 I R 倒叶, 称取g新鲜叶片, 剪成 c m长度的片段, 在常温黑暗条件下用 丙酮浸 提 h, 然后用P e r k i nE l m e r分光光度计进行叶绿 素、 类胡萝卜素含量的测定.重复次, 取平均值进 行分析. 光合指数测定 水稻灌浆期, 利用便携式光合作用仪(L I C O R, L I ) 在晴好天气的上午: : 田间测定 野生型I R 和突变体HM 的光合指数.测定部 位为剑叶中上部, 叶面积为c m , 使用 B 内置式红蓝光源, 光强为 m o l/ (m s) .分 别选取长
15、势相当的I R 和HM 各株, 测定其 净光合速率、 蒸腾速率和气孔导度, 重复测定次, 取平均值进行分析. 遗传分析 以HM 为母本分别与M o r o b e r e k a n、 I R 和 热研号杂交,F 套袋自交,F单本种植, 调查F、 F单株叶色表型, 进行遗传分析.并利用来源于 HM /M o r o b e r e k a n的一个F分离株系进行遗传 验证. 基因定位 根据亲本间分子标记的多态性, 利用来源于 HM /M o r o b e r e k a n的F群体中的淡绿叶单株作 为定位群体.苗期采用简易法提取亲本HM 、 M o r o b e r e k a n及HM
16、/M o r o b e r e k a nF群体中 株淡 绿 叶 个 体 的D NA, 同 时 采 用D NA分 池 法 ( b u l k e ds e g r e g a n t a n a l y s i s) 根据表型随机选取淡绿 叶和正常叶色单株各 株, 每单株取等量的叶片, 各自 混 合 提 取D NA作 为 淡 绿 叶 和 正 常 叶 色 的 D NA池.选取 对均匀分布于 条染色体上的 S S R标记, 用于亲本HM 和M o r o b e r e k a n的多态 性筛选, 筛选到的标记进一步用于D NA池的多态 性分析, 找出可能与淡绿叶基因连锁的标记.然后, 用连锁标
17、记对F 群体中的 个随机淡绿叶单株进 行分 析.根 据 电 泳 检 测 的 结 果, 将 具 有 突 变 体 HM 带型的记录为,M o r o b e r e k a n带型的记录 为, 而具有HM 和M o r o b e r e k a n双亲带型的记 录为, 并通过M a p M a k e r 作图软件进行连锁分 析和遗传作图.所用S S R标记的引物序列下载自 G r a m e n e网站(h t t p: / /www g r a m e n e o r g/ ) , 引物 由上海生工生物工程有限公司合成.P C R体系以 及产物检测采用S h i等 的方法. 结果与分析 HM
18、 的表型和主要农艺性状 突变体HM 与野生型I R 相比, 全生育期 所有叶片均表现为淡绿色( 图) , 该性状能稳定遗 传.突变体除了始穗期较野生型迟周, 株高显著 低于野生型外, 穗长、 单株有效穗、 毎株实粒数、 结实 率和千粒重均与野生型I R 无明显差异( 表) . HM 的光合色素含量 在分蘖期分别测定HM 和I R 倒叶的叶 绿素a、b和类胡萝卜素的含量.结果表明, 分蘖期 突变体HM 的叶绿素a、b及类胡萝卜素含量分 别仅为野生型I R 的 、 和 , 其 中叶绿素a、b都存在极显著差异, 而类胡萝卜素含 量无明显差异( 图) .叶绿素b含量的降幅明显大 于 叶 绿 素a, 叶
19、 绿 素a/b则 由 野 生 型 的上 升 至 中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i) 第 卷第期( 年 月) 表 I R 和突变体HM 农艺性状考察 T a b l e C o m p a r i s o no f a g r o n o m i c t r a i t sb e t w e e nI R a n dt h em u t a n tHM 材料 M a t e r i a l 株高 P l a n th e i g h t /c m 穗长 P a n i c l e l e n g t h /c m 每株实粒数 N o o f f i l l e dg r a
20、 i n s p e rp l a n t 每株有效穗数 N o o f e f f e c t i v e p a n i c l e sp e rp l a n t 千粒重 g r a i n w e i g h t/g 结实率 S e e ds e t t i n g r a t e/ I R HM 野生型与突变体在 水平上差异显著. S i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nw i l dt y p ea n dt h em u t a n ta t l e v e l 图 分蘖期I R 和突变体HM 的叶色表型 F i
21、g P h e n o t y p eo f I R a n dHM a t t i l l e r i n gs t a g e , 表明HM 的淡绿叶表型是由于叶绿素含量 尤其是叶绿素b含量的显著下降引起的,HM 是 一个叶绿素缺失突变体. HM 光合指数变化 为了分析叶色突变对HM 光合作用的影响, 在灌浆期对HM 和I R 剑叶的净光合速率、 气 孔导度和蒸腾速度个光合指数进行测定.发现突 变体HM 剑叶净光合速率下降了约 , 但蒸 腾速率上升了约 , 差异均达极显著水平, 而 气孔导度HM 与I R 无明显差异( 表) .结果 表明, 由于叶色突变,HM 的光合作用受到明显 影响,
22、体现在净光合速率显著降低, 蒸腾速率显著提 高. HM 遗传分析 以HM 为母本,M o r o b e r e k a n、 I R 和热研 号为父本构建HM /M o r o b e r e k a n、HM /热研 号和HM /I R 三个群体, 考查F 植株和F群体 野生型与突变体在 水平上差异显著. S i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nI R a n dHM a t l e v e l 图 分蘖期HM 与野生型I R 的光合色素含量 F i g P h o t o s y n t h e t i cp i g m
23、e n tc o n t e n t so fHM a n dw i l d t y p eI R a t t i l l e r i n gs t a g e 的叶片性状.结果表明, 三个组合的F 植株均表现 为正常叶色, 三个F 群体均出现明显的分离, 分别 表现正常叶色和淡绿叶两种表型.HM /M o r o b e r e k a n的F群体共 株, 其中正常叶色为 表 灌浆时期突变体HM 和I R 的剑叶光合指数 T a b l e P h o t o s y n t h e t i c i n d e x e so ff l a gl e a fa tf i l l i n gs
24、t a g ef o rHM a n dI R 材料 M a t e r i a l 净光合速率 N e tp h o t o s y n t h e t i c r a t e / (m o lms ) 气孔导度 S t o m a t a l c o n d u c t a n c e / (m o lms ) 蒸腾速率 T r a n s p i r a t i o n r a t e / (m o lms ) I R HM 野生型与突变体在 水平上差异显著. S i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nw i l dt y
25、p ea n dt h em u t a n ta t l e v e l 施勇烽等:水稻淡绿叶突变体HM 的遗传分析与基因定位 表 淡绿叶突变体HM 的遗传分析 T a b l e G e n e t i ca n a l y s i s o f t h ep a l eg r e e n l e a fm u t a n tHM 组合 C r o s s F F 总株数 T o t a l n o o f p l a n t s 正常叶色株数 N o o fn o r m a l p l a n t s 淡绿叶株数 N o o fp a l e g r e e np l a n t s (
26、 ) HM /M o r o b e r e k e n 正常叶色N o r m a l g r e e n HM /I R 正常叶色N o r m a l g r e e n HM /热研号HM /NK 正常叶色N o r m a l g r e e n 株, 淡绿叶 株, 卡平方测验表明正常叶色与淡绿 个体的分离比符合的比例( ) ;HM 与I R 的F群体共 株, 其中正 常叶色为 株, 淡绿叶为 株, 卡方测验表明 正常叶色个体与淡绿个体的分离比符合的比 例( ) .HM /热研号的F 群体共 株, 其中正常叶色为 株, 淡绿叶为 株, 卡方测验表明正常绿叶与淡绿叶个体的分离 比符合的
27、比例( ) ( 表) , 表明HM 的淡绿叶性状受单隐性核基因控制. 同时, 观察个来源于HM /M o r o b e r e k a n的F 分离株系的叶色表型分离情况, 在总共 个单株 中, 株为正常叶色, 株为淡绿叶, 两者的分离 比也符合( ) , 进一步说明 HM 的淡绿叶性状受单隐性核基因控制, 暂时将 该基因命名为 p g l HM . p g l HM 基因定位 采用分池法构建淡绿叶和正常叶色D NA池各 一个, 并用随机选取的 株来源于HM /M o r o b e r e k a n的F群体中的淡绿叶单株作为定位群体. 用均匀分布于水稻基因组 条染色体上 对 S S R标
28、记对HM 和M o r o b e r e k a n进行多态性筛 选, 其中 对在亲本间存在多态性.用这 对 标记对淡绿叶和正常叶色D NA池进行多态性分 析, 发现第 染色 体 短 臂 上RM 、RM 、 RM 、RM 、RM 、RM 、RM 和RM 在两 个池中 均 表 现 多 态 性, 初 步 确 定 HM 的淡绿叶基因 p g l HM 可能位于第 染色 体短臂.为了明确淡绿叶基因 p g l HM 的位置, 用 这些标记检测 个淡绿叶 单株, 发现RM 、 RM 和RM 分别有、和个单交换个 体,RM 与淡绿叶基因p g lHM 表现紧密连锁 ( 图) .根据定位群体的检测结果用M
29、 a p M a k e r 软件 进 行 分 析,将 淡 绿 叶 基 因 p g l HM 定 位 在 RM 和RM 之 间,与RM 和 RM 的遗传距离分别为和c M( 图) . 淡绿叶基因 p g l HM 的定位区间物理距离约 k b,包 含A C 、A C 、A C 和 A C 四个重叠B A C克隆( 图) . 讨论 叶色突变体是一种肉眼明显可见的形态变异, 主要是由于基因突变造成叶绿体缺失、 结构异常和 叶绿素含量的改变.由L 谷氨酸t R NA起始的叶 绿素合成途径包含 步酶促反应, 个基因编码 的关键酶在此过程发挥着重要作用 .拟南芥中 所有酶基因都已被鉴定, 但水稻中仅有编
30、码个酶 的个基因被克隆 , .叶绿素a氧化酶( C AO) PHM ;PM o r o b e r e k a n;FHM /M o r o b e r e k a n;泳道 个F淡绿叶单株. P,HM ;P,M o r o b e r e k a n;F,HM /M o r o b e r e k a n;L a n e st o , Fi n d i v i d u a l p l a n t sw i t hp a l eg r e e n l e a fp h e n o t y p e 图 标记RM 在 个F 淡绿叶单株中的分离情况 F i g RM g e n o t y p eo
31、 f Fi n d i v i d u a l p l a n t sw i t hp a l eg r e e n l e a fp h e n o t y p e 中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i) 第 卷第期( 年 月) 图 淡绿叶基因p g l HM 在第 染色体上的分子定位 F i g M o l e c u l a rm a p p i n go f p g l HM o nt h e s h o r t a r mo f c h r o m o s o m e 是叶绿素b生成过程中的关键酶,L e e等 通过同 源法 克 隆 了 水 稻O s C A O 和
32、O s C A O 基 因,O s C A O 的纯合突变体叶色呈淡绿色, 不含叶绿素b, 它的叶绿素a含量也仅为野生型的 .镁螯合 酶催化镁离子与原卟啉螯合产生镁原卟啉,水 稻中编码该酶H亚基、D亚基和亚基的基因突变 会造成镁螯合酶活性下降, 影响叶绿素的合成 . 水稻突变体y g l 、 f g l 、 y s分别表现黄绿叶、 褪 绿叶、 黄绿叶表型, 通过图位克隆法鉴定了相应的 O s CHL G,O s P O R B和O s D V R基因, 分别编码叶 绿素合酶、NA D P H原叶绿素酸酯氧化还原酶以及 二乙烯还原酶.这些酶功能的异常阻碍了叶绿素合 成, 改变了叶绿体中各种色素的
33、比例, 引起叶色变 异 , , . 一些与叶绿体发育相关的基因突变也会影响叶 绿素合成, 产生变异的叶色表型.水稻转绿突变体 v是由于编码鸟苷酸激酶( p t /m t GK) 的基因突变, 导致叶绿体分化受到抑制, 在特定温度下叶片因不 含叶绿体而白化 .转绿突变体v 和条斑叶突变 体s t 分 别 由 于 编 码 核 糖 核 苷 酸 还 原 酶 大 亚 基 (R N R L ) 和小亚基(R N R S ) 的基因发生突变, 核 糖核苷酸还原酶活性明显下降, 导致与质体转录/翻 译相关基因的表达降低, 影响叶绿体的发育 .分 子伴侣基因O s C p n 对R u b i s c o大亚基
34、的折叠 起着关键作用, 该基因的突变会使水稻幼苗产生淡 绿叶表型, 第叶后发育停滞 .水稻三十五肽重 复蛋白( P P R) 在叶绿体发育过程中有重要作用, 如 果抑制O s P P R 基因的表达, 就会导致典型的缺 绿, 甚至白化致死 , 而线粒体 P P R蛋白编码基因 MP R 的T o s 敲除突变体产生淡绿叶表型和发 育迟缓症状, 该基因可能参与线粒体与叶绿体协调 互作过程 .斑马叶相关基因Z 编码类胡萝卜素 异构酶, 催化顺式番茄红素转化为全反式番茄红素, 参与水稻的光保护作用, 该基因不同位点的突变会 产生明显的表型差异 , . 第 染色体已报道了多个叶色基因, 利用经典 遗传
35、学方法定位了转绿基因v 和v , 斑马叶基因 z 和z , 其中z 基因已被克隆 , , 利用分子标记 定位的基因有s g r a 、 x n t 、 y l 、 s y l 和 Y g l .叶色突变体s g r a 是在中花 的后代中发 现的, 幼苗期叶色正常, 而叶期以后新生叶白 化, 随 后 转 绿, 该 突 变 基 因 被 定 位 在I DM 和 RM 之间, 物理距离约为 k b .黄化叶 基因x n t精细定位于RM 和I D 之间约 k b的区间内 .黄绿叶突变体Y g l 是EM S诱变 秀水 获得的, 目的基因定位在第 染色体上两 个I n D e l标记约 k b区间内,
36、 并测序发现与叶绿 体前体合成有关的候选基因发生了外显子上一个碱 基的 突 变 .本 研 究 中, I R 的EM S突 变 体 HM 表现全生育期的淡绿叶, 其分蘖期叶绿素含 量明显低于I R , 灌浆期净光合速率明显降低而蒸 腾速率显著增强, 淡绿叶基因 p g l HM 定位于第 染色体短臂RM 和RM 之间.淡绿叶基 因 p g l HM 与Y g l所在区间有部分重叠, 但两个突 变体叶片表型上有所差异, 是否是同一基因有待进 一步研究证明. 参考文献: H a nSH,S a k u r a b aY,K o hHJ,e t a l L e a f v a r i e g a t
37、i o n i n t h e r i c ez e b r a m u t a n t i sc a u s e db yp h o t o p e r i o d i ca c c u m u l a t i o no f t e t r a C i s l y c o p e n ea n ds i n g l e to x y g e n M o lC e l l s, , : W uZ,Z h a n gX,H eB,e t a l AC h l o r o p h y l l d e f i c i e n t r i c em u 施勇烽等:水稻淡绿叶突变体HM 的遗传分析与基因
38、定位 t a n tw i t hi m p a i r e dc h l o r o p h y l l i d ee s t e r i f i c a t i o ni nc h l o r o p h y l l b i o s y n t h e s i s P l a n tP h y s i o l, , : N a k a n i s h iH,N o z u eH,S u z u k iK,e ta l C h a r a c t e r i z a t i o no f t h eA r a b i d o p s i s t h a l i a n am u t a n
39、tp c b w h i c ha c c u m u l a t e s d i v i n y l c h l o r o p h y l l s P l a n tC e l lP h y s i o l, , : T a n a k aR,K o s h i n oY,S a w aS,e t a l O v e r e x p r e s s i o no f c h l o r o p h y l l i d eao x y g e n a s e(C AO)e n l a r g e st h ea n t e n n as i z eo f p h o t o s y s t
40、e m i nA r a b i d o p s i s t h a l i a n aP l a n tJ, , : R o u s s e l lDL,T h o m p s o nDL,P a l l a r d ySG,e ta l C h l o r o p l a s t s t r u c t u r ea n d f u n c t i o n i s a l t e r e d i n t h eN C S m a i z em i t o c h o n d r i a lm u t a n t P l a n tP h y s i o l, , : P r i n aAR
41、,A r i a sMC,L a i n e zV,e t a l Ac y t o p l a s m i c a l l y i n h e r i t e d m u t a n tc o n t r o l l i n ge a r l yc h l o r o p l a s td e v e l o p m e n ti n b a r l e ys e e d l i n g s T h e o rA p p lG e n e t, , : G i a r d iM T,K u c e r aT,B r i a n t a i s JM,e t a l D e c r e a s e dp h o t o s y s t e m c o r ep h o s p h o r y l a t i o ni nay e l l o w g r e e n m u t a n to f w h e a t s h o w i n gm o n o p h a s i c f l u o r e s c e n c e i n d u c t i o nc u r v e P l a
链接地址:https://www.31doc.com/p-3334100.html