水稻新裂颖突变体sg1的遗传分析与基因定位.pdf
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1、水稻新裂颖突变体s g 的遗传分析与基因定位 曾生元, 郭旻 李荣德 盛生兰 龚红兵 严长杰, (扬州大学 江苏省作物遗传生理重点实验室/教育部植物功能基因组学重点实验室,江苏 扬州 ;江苏丘陵地区镇江农业科 学研究所,江苏 句容 ;通讯联系人,E m a i l:c j y a n y z u e d u c n) G e n e t i cA n a l y s i sa n dF i n eM a p p i n gf o raN o v e ls p l i tg l u m eM u t a n t i nR i c e ZE NGS h e n g y u a n ,GUOM i
2、n,L IR o n g d e , SHE NGS h e n g l a n ,GONGH o n g b i n,YANC h a n g j i e, (J i a n g s uK e yL a b o r a t o r yo fC r o pG e n e t i c s a n dP h y s i o l o g y/K e yL a b o r a t o r yo fP l a n tF u n c t i o n a lG e n o m i c s,M i n i s t r yo fE d u c a t i o n o fC h i n a,A g r i c u
3、 l t u r a lC o l l e g eo fY a n g z h o uU n i v e r s i t y,Y a n g z h o u ,C h i n a;Z h e n j i a n gI n s t i t u t eo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s o ft h eN i n g Z h e nH i l l yD i s t r i c t,J u r o n g ,C h i n a;C o r r e s p o n d i n ga u t h o r,E m a i l:c j y a n y z ue
4、 d uc n) Z E N GY u a n,GUO M i n,L IR o n g d e,e t a l G e n e t i ca n a l y s i sa n df i n em a p p i n gf o ran o v e ls p l i tg l u m em u t a n t i nr i c e C h i nJ r i c eS c i, , () : A b s t r a c t:As p l i tg l u m em u t a n t i sf r o mt h em u t a n t l i b r a r yo f i n d i c av
5、a r i e t yZ h o n g x i a n r a d i a t e db y C o r a y C o m p a r e dt o i t sw i l dt y p e,t h em u t a n th a sn o to n l ys p l i tg l u m e s,b u t a l s oc h a r a c t e r i z e db ye a r l yh e a d i n g,l o w e rp l a n t h e i g h t,r e d u c e ds e e ds e t t i n gr a t ea n dd e g e n
6、 e r a t e ds p i k e l e t s,w h i c hi m p l i e st h a tt h em u t a t i o nh a sap l e i o t r o p i ce f f e c t G e n e t i ca n d m o l e c u l a ra n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h e m u t a n tw a sc o n t r o l l e db yar e c e s s i v en u c l e a rg e n e,t e m p o r a l l y d e
7、s i g n a t e da ss p l i tg l u m e(s g ) ,a n dt h e nS G w a s f i n em a p p e dt oa k bD NAr e g i o nb e t w e e nt h eS T Sm a r k e r s M z a n dM z o n,w h e r es i xO R F s i nt o t a lw e r ep r e d i c t e d O nt h eb a s i so f t h e l o c a t i o no fS G ,i t i sd e d u c e d t h a tS
8、G i san o v e l g e n er e g u l a t i n gt h er i c eg l u m ed e v e l o p m e n t K e yw o r d s:r i c e;f l o w e ro r g a n;s g ;f i n em a p p i n g 曾生元,郭旻,李荣德,等水稻新裂颖突变体s g 的遗传分析与基因定位中国水稻科学, , () : 摘 要:从中籼 辐射突变体库中获得一个颖花开裂突变体(s p l i tg l u m e , s g ) , 表型分析发现该突变体不仅颖壳异 常, 且伴随着生育期提前, 植株变矮, 颖花退化
9、等现象, 结实率也显著降低.遗传分析和分子生物学分析结果表明该突变受 对隐性核基因控制, 并最终将其定位在水稻第染色体上分子标记M z 与M z 之间, 物理距离约为 k b, 这是一种 控制颖花发育的新基因, 通过预测发现该区段内存在个开放阅读框. 关键词:水稻;花器官;颖花开裂突变体;精细定位 中图分类号:Q ;Q 文献标识码:A 文章编号: ( ) 植物花器官的发生发育与其自身的繁衍紧密相 关, 其发育受到一系列花器官同源异型基因调控. 通过对双子叶模式植物拟南芥和金鱼草的花器官突 变体的分子生物学研究, 已建立起在花器官发育过 程中同源异型基因作用的A B C模型, 即A、B、C三 组
10、基因分别提供三种不同的同源异型功能控制四轮 花器官( 花萼、 花瓣、 雄蕊和心皮) 的形成, 其作用方 式可大致表示为:A类基因控制第、 轮花器官的 发育, 其功能丧失会使第轮的萼片变为心皮, 第 轮的花瓣变成雄蕊; B类基因控制第、轮花器官 的发育, 其功能丧失会使第轮花瓣变为萼片, 第 轮的雄蕊变为心皮;C类基因控制第、 轮花器官 的发育, 其功能丧失会使第轮的雄蕊变为花瓣, 第 轮的心皮变成萼片, 即同一组基因控制相邻两轮 花器官的发育, 而且A、C两类基因彼此负控制, 也 就是说C类基因 突变则A类 基 因 表 达, 反 之 亦 然 .随后的研究将 A B C模型发展成A B C D
11、E模 型.双 子 叶 植 物 中D功 能 基 因 主 要 有S TK、 F B P 、F B P 等, 与C功能基因冗余调控胚珠的 发育 ,; E功能基因主要是S E P A L L A T A(S E P) 收稿日期: ;修改稿收到日期: . 基金项目:国家自然科学基金资助项目( ) ; 农业部转基因专项( Z X ) ; 江苏省自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (B K ;B K ) ; 江苏省六大人才高峰项目; 江苏高校优势学科建设工程项目; 江苏省农业科技自主创新资金资助项目C X ( ) . 中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i) , , ( ) : h t
12、t p: / /w w w r i c e s c i c n D O I: /j i s s n 类,它们参与所有花器官的发育 . 作为单子叶模式作物, 水稻花器官的形成与最 终的产量密切相关.水稻的颖花从外到内依次由 个外稃、 个内稃、个浆片、枚雄蕊和枚雌蕊构 成, 与双子叶植物相比, 它没有明显的花萼与花瓣结 构.外稃、 内稃和浆片是禾本科植物花器官所特有 的结构, 它们的发育过程和进化起源一直是植物进 化发育学研究的热点之一.随着研究的深入, 外稃 类似双子叶植物托叶的属性, 内稃相当于萼片, 浆片 具有与花瓣相似的特性, 这些观点逐渐得到了广泛 认可 ,.越来越多的研究表明水稻也基本
13、适用 A B C D E模型, 与双子叶植物相比, 水稻调控内轮花 器官( 雄蕊和雌蕊)特征的B、C和D类基因虽然有 部分序列和功能的分化, 但还是表现出了较高的保 守性 , 而决定外轮花器官的 A和E功能基因存 在很大的功能分化.水稻中已发现了个与拟南芥 A类 基 因 直 系 同 源 的 基 因O s MAD S 、O s MAD S 、O s MAD S 、O s MAD S , , 和 个 S E P A L A T A类 基 因O s MAD S 、O s MAD S 、O s MAD S 、O s MAD S 和O s MAD S , , 但它们之 间的表达模式具有很大的差异, 目前
14、研究证明其中 只 有O s MAD S (D E P) , 和 O s MAD S ( LHS ) , 直接调控水稻外稃和内稃的特征发 育.目前, 水稻等单子叶植物外轮花器官的发育调 控机制仍然不清楚, 发掘、 克隆更多的水稻外轮花器 官突变体基因对了解单子叶植物调控花发育的分子 机制具有重要意义. 本研究通过辐射水稻品种中籼 , 获得了一 个内外稃开裂突变体, 并对该突变体进行了形态学 观察、 农艺性状以及遗传分析.在此基础上, 利用分 子标记对相关基因进行了精细定位, 为进一步克隆 该基因提供参考. 材料与方法 植物材料 在以 C o 射线辐照籼稻品种中籼 干种 子的M代 中 得 到, 裂
15、 颖 突 变 体 ( 暂 命 名 为s p l i t g l u m e,s g ) 经过连续多代自交种植, 确认突变性 状能稳定 遗 传.正 常 材 料 包 括 野 生 型 品 种 中 籼 ( 籼稻) , 粳稻品种中花 、 越光. 农艺性状考查 正常田间管理, 抽穗期观察颖花形态, 统计颖花 开裂的数量与比例.成熟期测量株高、 穗长、 结实率 等农艺性状, 并利用S P S S统计软件进行数据分析. F遗传分析群体和基因定位群体的构建 以突变体s g 为母本与粳型品种越光杂交,F 代自交获得F , 同时以中花 与突变体杂交, 获得 F, 统计F群体中野生型和裂颖表型的植株数目, 进行统计分
16、析. 基因定位群体包括中花 /s g 、 s g /越光F 群体中所有裂颖单株以及部分正常表型单株. 水稻D N A提取、P C R扩增 水稻 基 因 组D NA的 提 取 参 照S c o t t等 的 C T A B法 , 略有改动.P C R扩增采用 L的反 应体系, 其中模板D NA L, P C R缓冲液 L, mm o l /L的M g C l L,mm o l /L的 d NT PL,m o l /L的引物 L, T a q 酶 U, 加d d HO补足 L;P C R扩增条件如下: 预变性m i n; 下变性 s, 下 退火 s( 温度因引物不同而异) , 下延伸 s ( 不同
17、长度的预期产物按k b/m i n调整延伸时间) , 扩增 个循环; 下延伸 m i n,下保温. P C R产物首先在琼脂糖凝胶中电泳, 经溴 化乙锭染色后在凝胶成像仪上拍照, 如果在琼 脂糖凝胶中没有多态, 则在垂直平板聚丙烯酰 胺凝胶上电泳, 经 硝酸银染色后观测. 基因定位 首先利用S S R标记对分离群体的个亲本 ( s g 突变体和中花 ) 进行多态性分析.连锁分析 采用小群体法, 将中花 /s g 组合F 代中 株裂 颖表型单株进行连锁分析, 同时用 株正常表型单 株作为对照, 再在可能区段扩大群体, 发展标记进行 初步定位, 并用 个正常株进行验证, 确定不是标 记的偏分离引起
18、的连锁.用S S R标记对F 中 株 裂颖单株进行分析, 根据这些标记分析的结果, 用 M a p M a k e r软件 进行连锁分析, 利用 K o s a m b i函数将 重组率转化 为遗传 距 离 (c e n t i M o r g a n, c M) . 在初步 定位的基础 上, 根据N C B I网 站 (h t t p : / /www n c b i n l m n i hg o v/ ) 上公布的水稻品种 日本晴全基因组序列, 获取第染色体相应的粳稻 序列, 再通过B L A S T(b a s i cl o c a la l i g n m e n ts e a r c
19、 h t o o l) 搜索籼稻 ( ) 序列数据库 (h t t p: / /www r i s e g e n o m i c s o r g c n) , 比对在初定位中确定的基因 区段内籼稻和粳稻D NA序列多态性, 根据插入或 者缺 失 差 异 利 用 软 件P r i m e r 和V e c t o rNT I 曾生元等:水稻新裂颖突变体s g 的遗传分析与基因定位 图 突变体和野生型的株型(A) 、 颖花(B) 及突变体籽粒形态(C) F i g G r o s sm o r p h o l o g y(A) ,a n ds p i k e l e t s(B)o fs g m
20、 u t a n t a n d i t sw i l dt y p e,a n dg r a i ns h a p e(C)a tm a t u r e s t a g eo fs g m u t a n t 设计S T S(s e q u e n c et a g g e ds i t e s) 标记.进一步用 存在多态的标记分析中花 /s g 、 s g /越光F群 体中所有裂颖单株共 株, 进行精细定位. 所用引物由上海生工生物工程有限公司或上海 英峻生物公司合成. D N A序列分析 参 照T I G R网 站 (h t t p: / /r i c e p l a n t b i o
21、 l o g y m s u e d u/ ) 进行基因预测.根据预测的基因, 设计 引物分别扩增突变体和野生型品种D NA,P C R产 物直接测序或连到p MD T载体上进行测序, 测 序结果用V e c t o rNT I 软件比对分析.P C R产 物回收采用T a K a R a回收试剂盒, 序列测定在上海 生工生物工程有限公司完成. 结果与分析 裂颖突变体的形态特征 抽穗至开花, 大多数突变体颖花( 约 ) 自 动开裂, 内外稃不抱合, 扬花时花丝不伸长至颖花顶 端, 而是从基部或中部裂缝中伸出, 完成散粉, 花后 颖壳不闭合, 呈裂开状态, 少数颖花无开裂现象, 花 后能正常闭合
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- 水稻 新裂颖 突变体 sg1 遗传 分析 基因 定位
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